尋常型銀屑病血熱證患者外周血Th17細胞活化和增殖相關因子的表達

田海剛，吳厚男，王建峰，郭付云，黃彬彬，楊旭芳，苗朝陽，張曉艷*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京大學醫學部細胞分析實驗室，北京 100083；

3.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；4.北京大學醫學部，北京 100083；5.中日友好醫院皮膚科，北京 100029）

尋常型銀屑病血熱證患者外周血Th17細胞活化和增殖相關因子的表達

田海剛1，吳厚男2，王建峰1，郭付云1，黃彬彬1，楊旭芳3，苗朝陽4，張曉艷5*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京大學醫學部細胞分析實驗室，北京 100083；

3.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；4.北京大學醫學部，北京 100083；5.中日友好醫院皮膚科，北京 100029）

目的 探討Th17細胞活化和增殖相關因子在尋常型銀屑病血熱證發病機制中的作用以及尋常型銀屑病血熱證的物質基礎與辨證依據。方法 收集我院皮膚科門診尋常型銀屑病血熱證患者12例為觀察組，11例正常人為對照組。通過多色流式細胞術檢測兩組外周血Thl7細胞活化相關因子HLA-DR、增殖因子Ki-67表達水平。結果 觀察組外周血Thl7細胞活化因子HLA-DR的表達及增殖因子Ki-67的表達均高于對照組（P<0.05）；但活化因子HLA-DR及增殖因子Ki-67與銀屑病的病情及嚴重程度指數（PASI）評分均無相關性（r1=-0.021，r2=0.098，均P>0.05）。結論 Th17細胞活化因子HLA-DR和增殖因子Ki-67在銀屑病血熱證患者外周血中表達上調，提示銀屑病血熱證患者外周血Th17細胞處于高活化狀態且增殖活躍，二者可能間接參與了銀屑病血熱證的發病過程，是銀屑病血熱證新的物質基礎與辨證依據。

尋常型銀屑病；血熱證；Th17細胞；活化；增殖

近年來，銀屑病被認為是一種T細胞介導的自身免疫性炎癥性皮膚病，尤其是Th17細胞在本病的發病中發揮了重要作用，盡管國內外對其發病機制做了大量研究，但迄今其病因及發病機制仍不明確。中醫學多認為急性期銀屑病的主要病因是 “血分有熱”，從而確立血熱證的論治策略。本研究應用多色流式細胞儀，對銀屑病血熱證患者外周血CD4+的Th17淋巴細胞活化相關標志HLA-DR和增殖核蛋白Ki-67進行檢測，研究銀屑病血熱證患者外周血是否存在Th17細胞活化和增殖，并與健康人進行比較，為進一步闡明銀屑病免疫發病機制和銀屑病血熱證物質基礎提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 西醫診斷標準 參照 《臨床皮膚病學》[1]，皮損為紅色的丘疹、斑疹，可融合成片，邊緣明顯，上覆多層銀白色鱗屑，將鱗屑刮去后有發亮薄膜，再刮除薄屑有點狀出血現象 (稱為薄膜現象和點狀出血現象，即Auspitz征)。所有病例均有典型皮損并經組織病理證實。

1.1.2 中醫診斷標準 銀屑病血熱證的診斷標準參照《中華人民共和國中醫藥行業標準·中醫皮膚科病癥診斷療效標準》[2]，其主癥包括新皮損不斷出現，以丘疹、斑丘疹為主，皮損基底皮膚顏色鮮紅，刮去鱗屑有點狀出血，有同形反應；次癥包括初發或復發，可有不同程度的瘙癢、心煩、口渴或口干、便秘、尿黃、舌質紅、苔黃、脈數，具備以上主癥及次癥2項以上者即可診斷。

1.1.3 納入標準 （1）符合西醫尋常型銀屑病診斷標準；（2）符合銀屑病血熱證的辨證標準；（3）年齡在18～65歲，無家族史，男女不限；（4）3個月內無系統應用免疫抑制劑、糖皮質激素或維甲酸類藥物治療史，近2周內無外用藥物史；（5）身心健康，無其他內科疾病，血尿便常規、肝腎功能及其他生化指標正常；（6）簽署知情同意書。

1.1.4 排除標準 （1）關節型、膿皰型、紅皮病型銀屑病；（2）妊娠、孕婦、哺乳期患者；（3）有嚴重心、肝、腎疾患，糖尿病、高血壓、高血脂、惡性腫瘤等系統疾病患者；（4）既往有病毒性肝炎等傳染病病史。

1.2 一般資料

收集2013年12月至2014年3月我院皮膚科門診診斷為尋常型銀屑病血熱證患者12例 （觀察組），其中男6例，女6例；年齡18～47歲，平均(30.58±9.74)歲；病程2～38.5年，平均 13.07年；皮損面積5.5%～82%，平均31.2%；銀屑病的病情及嚴重程度指數（PASI）評分6～38.9，平均14.53。正常人11例為對照組，其中男6例，女5例；年齡23～34歲，平均（28.36±3.78）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.3 檢測方法

1.3.1 主要試劑與儀器 APC-H7-CD3，BV421-CD4，PE-Cy7-CD56，FITC-HLA-DR，PE-TCR-γδ均購自BD公司；BV570-CD8(購自BioLegend公司)；PerCP-Cyanine5.5-IL-17A，FITC-Ki-67，APCRORgammat，FITC-MOUSE-IgG2a均購自 eBioscience公司；PMA(佛波脂)，Ionomycin(離子霉素)，Brefeldin-A(BFA，布雷菲德霉素A)均為Sigma公司產品；SEries 8000DH CO2Incubator（Thermo scientific公司），GALLIOS流式細胞儀（BECKMAN COULTER公司）。

1.3.2 外周血標本采集與處理 于無菌狀態下采集尋常型銀屑病血熱證患者與健康志愿者清晨空腹靜脈血2 mL，用肝素鈉抗凝管，標本的處理在4 h之內完成。

1.3.3 外周血細胞的體外培養刺激 刺激：在流式管中加入500 μL全血+500 μL預先配好的1640培養液、PMA工作液 （100 ng/mL）、Ionomycin工作液（1 μg/mL）、BFA工作液 （10 μg/mL）。孵育：將加好培養液的標本放置37℃、5%二氧化碳培養箱中孵育5 h，期間每隔1 h輕輕搖晃混勻1次。培養結束后，收集細胞。

1.3.4 細胞染色 表面標記的染色：在相應的單陽對照管加入對應的單個抗體 5 μL，Mouse-IgG、TCR-γδ和HLA-DR加量為10 μL，室溫避光孵育30 min。同型對照管中加入上述量的抗體MOUSEIgG2a、CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8，室溫避光孵育30 min。樣本管1中加入上述量抗體HLA-DR、CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8， 室溫避光孵育30 min。樣本管2中加入上述量抗體CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8，室溫避光孵育30 min。破膜：在單陽對照管HLA-DR、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8、CD56中各加入1X破膜液1 mL，混勻，室溫避光放置30 min。所有管加入2 mL buffer，振動混勻1 300 r／min，4℃，離心 5 min，去上清后再加入2 mL buffer，1 300 r／min，4℃，離心5 min，去上清。核內染色：在1、2單陽對照管中加入IL-17A和RORC2對應抗體各5 μL，室溫避光孵育30 min。樣本管1中加入抗體IL-17A和RORC2；樣本2管中加入IL-17A和RORC2，Ki-67；30 min避光孵育后，各管加2 mL的buffer洗滌，1 300 r／min，4℃，離心5 min。去上清，加200 μL PBS懸浮細胞，混勻后上機檢測。用Gallios軟件進行數據分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組Th17細胞免疫活化分子HLA-DR表達及增殖相關分子Ki-67表達的比較

觀察組Th17細胞表面活化標記物HLA-DR的表達率及增殖標記物Ki-67表達率均高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 Th17細胞免疫活化分子HLA-DR表達及增殖相關分子Ki-67表達的比較 （±s，%）

表1 Th17細胞免疫活化分子HLA-DR表達及增殖相關分子Ki-67表達的比較 （±s，%）

注：與對照組比較△P<0.05。

組別對照組觀察組例數11 12 HLA-DR Ki-67 8.016±2.334 5.665±2.251 11.686±4.799△ 8.727±3.854△

2.2 觀察組外周血Th17細胞活化狀態及增殖程度與PASI評分的相關性

通過Spearman和Kendall相關系數檢驗，提示Th17細胞活化狀態及增殖程度與PASI評分均無相關性（r1=-0.021，r2=0.098，均P>0.05）。

3 討論

銀屑病的病因和發病機制尚未完全明確。目前認為是T細胞與角質形成細胞相互作用所致，由活化T細胞產生的淋巴因子刺激表皮增殖，而增殖角質形成細胞又釋放其他細胞因子增強活化T細胞作用，形成T細胞介導的惡性循環。可見，活化的T細胞是銀屑病發病機制中的主要調節因子[3]。組織病理表現為角質形成細胞增殖和混合T淋巴細胞浸潤[4-5]。T淋巴細胞亞群Th17細胞是近年發現的一種新型CD4+效應性T細胞，以其特征性的分泌IL-17而命名。由于其在銀屑病等自身免疫性疾病中的免疫調節和致病性作用，已受到皮膚病等相關研究領域極大的關注。研究表明，Th17細胞參與了銀屑病的發病[6-7]，其受到外來抗原刺激后，活化分泌一系列炎癥性細胞因子，從而促進角質形成細胞增殖和皮膚炎癥。中醫學認為銀屑病多是以 “血分有熱”為主要病機特點，血熱、血瘀、血燥證為其基本證候[8-9]，雖然在銀屑病證候的研究中，學者們試圖通過現代分子生物學技術揭示其微觀實質，但仍處于探索中。本研究中，我們選擇了T細胞中晚期免疫活化分子HLA-DR和增殖相關核蛋白Ki-67作為研究Th17細胞活化和增殖的觀察指標，初步探討其在銀屑病血熱證中的作用及與病情嚴重程度的關系，為銀屑病血熱證提供新的物質基礎和辨證依據。

正常情況下單核細胞高表達Ⅱ類主要組織相容性(MHC)抗原HLA-DR。HLA-DR是單核巨噬細胞提呈外來抗原最重要的分子，在活化特異性T淋巴細胞進行免疫應答過程中具有關鍵性作用。CD4+T淋巴細胞通過其表面的TCR識別單核巨噬細胞表面HLA-DR分子與外來抗原肽形成的復合物，與之結合后提供第一刺激信號而啟動T細胞活化增殖及特異性免疫應答。因此，單核細胞表面HLA-DR的表達和機體的免疫功能密切相關，也是銀屑病發病機制的一個潛在因素。Ki67是增殖細胞表達的一種核抗原，最早是在增殖細胞中發現的，參與細胞的有絲分裂，是細胞增殖的重要標志物，也是目前眾所周知的核增殖標志物。關于Ki-67的研究，目前從文獻來看大多集中在腫瘤等增殖性疾病中，銀屑病的表皮過度增殖伴角化不全，與細胞增殖和凋亡，細胞周期調控紊亂有關系。Ki-67在此方面的研究相對較少，基于上述認識，本課題研究小組嘗試從Th17細胞的活化和增殖角度研究銀屑病血熱證的免疫發病機制。

由于Th17細胞沒有特異性的標志，其主要分泌IL-17外，其他諸如NK，iNK，γδT等細胞也表達IL-17[10-11]，RORC2是其特異性的轉錄因子，對于標記Th17細胞具有重要作用。因此，本實驗中，分別標記了這些細胞的表面標記，從而從多個產IL-17的T淋巴細胞中篩選出Th17細胞，進一步研究其活化狀態和增殖程度。研究結果表明，血熱證銀屑病患者外周血Th17細胞表面活化相關分子HLADR和核內增殖蛋白Ki-67的表達均高于正常對照，說明血熱證銀屑病患者外周血中Th17細胞處于高活化狀態，且增殖活躍，提示HLA-DR和Ki-67在銀屑病血熱證中具有重要作用，可能促使Th17細胞分泌下游的促炎癥效應細胞因子 IL-17A、IL-17F、IL-21等，促進T淋巴細胞的有絲分裂，并能促進細胞由G1期向S期過渡，導致具有相同抗原特異性的細胞克隆擴增，大大增強了對特定抗原的免疫應答，引起機體的免疫損傷，或通過免疫炎癥通路誘導角質形成細胞增殖，從而表現為角化亢進。有學者通過免疫組化和逆轉錄聚合酶鏈反應技術（RT-PCR方法）研究銀屑病患者皮損中Ki-67的分布和Ki-67mRNA的表達，陽性細胞主要表達在基底細胞層和棘細胞層，且陽性率高于正常對照組，Ki-67mRNA的表達也顯著高于正常表皮[12]，且Ki-67的表達與PASI呈正相關[13]。本實驗結果部分與上述研究類似，但未發現Th17細胞的免疫活化分子HLA-DR和增殖蛋白Ki-67的表達與PASI呈相關性，可能與本研究樣本量小，采血時間有關，和或在銀屑病外周血和皮膚中，Ki-67的表達是否具有一致性有關，有待于進一步研究。

本研究的意義在于利用多色流式細胞儀進行檢測和分析銀屑病血熱證患者外周血Th17細胞的活化和增殖狀態，其中也檢測了抑制性T細胞、NKT細胞、γδT細胞的活化與增殖，以進行不同產IL-17的T淋巴細胞的活化與增殖比較分析，數據未能在此顯示。本研究給銀屑病血熱證的免疫發病機制和物質基礎研究提供了新的理論依據和思路，同時對于銀屑病血熱證循環中活化和增殖的Th17細胞的理解，也將有助于銀屑病的免疫調節治療。

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（本文編輯 馬 薇）

The Expression of Th17 Cells Activation and Proliferation Related Factors in Peripheral Blood of Patients with Blood-heat Syndrome of Psoriasis Vulgaris

TIAN Haigang1,WU Hounan2,WANG Jianfeng1,GUO Fuyun1,HUANG Binbin1,YANG Xufang3, MIAO Chaoyang4,ZHANG Xiaoyan5*
（1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Cell Analytical Laboratory, Peking University Health Science Center,Beijing 100083,China;3.Inner Mongolia Medical University, Hohhot,Neimenggu 010110,China;4.Peking University Health Science Center,Beijing 100083, China;5.Department of Dermatology,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China）

Objective To explore the role of Th17 cell activation and proliferation relatedfactors in the pathogenesis of psoriasis vulgaris of blood-heat syndrome and material foundation as well as dialectical basis of blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris.Methods 12 patients with blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris were enrolled from our hospital dermatology clinic, and 11 cases of healthy individuals as normal control.The expression level of Thl7 cells activation related factor HLA-DR,proliferation factor Ki-67 in peripheral blood of patients with blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris and healthy subjects were examined by multicolor flow cytometry.Results Thelevel of Thl7 cells activated factor HLA-DR in peripheral blood of patients was high expression compared with control group (11.686%±4.799%vs 8.016%±2.334%, P<0.05),the expression of proliferation factor Ki-67 was also increased compared to control group (8.727%±3.854%vs 5.665%±2.251%,P<0.05).But the activation factor HLA-DR,proliferation factor Ki-67 and psoriasis area and severity index(PASI)score did not show correlations(r1=0.021, r2=0.098,P>0.05).Conclusion The high expression of Th17 cell activation factor HLA-DR and proliferation factor Ki-67 in peripheral blood of patients with psoriasis of blood-heat syndrome, indicates theperipheral blood of patients with psoriasis of blood-heat syndrome-Th17 cells were at a high state of activation and proliferation.Both HLA-DR and Ki-67 may indirectly involved in the pathogenesis process of psoriasis of blood-heat syndrome.They are probably novel material foundations and dialectical basis of blood-heat syndrome of psoriasis.

psoriasis vulgaris;blood-heat syndrome;Th17cell;activation;proliferation

R758.63

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.010.039.05

2014－04－11

國家自然科學基金面上資助項目（81171502）。

田海剛，男，醫學博士,主要從事中醫藥治療銀屑病療效機制研究。

*張曉艷，女，主任醫師，博士研究生導師，zhangxiaoyan2@medmail.com.cn。