利用偏光影像技術定量觀察大鼠胸主動脈中纖維結構＊

陳 睿，陳 輝，雷 燕*，馬淑驊，王 毅*

(1.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700;2.北京急救中心，北京 100031)

光波入射各向異性的物質后，都要發生雙折射(除特殊方向以外)，分解為振動方向互相垂直，傳播速度不同，折射率不等的兩束偏振光波，物質的這種屬性，被稱為雙折光性［1］。雙折射是樣品的分子排列的本質屬性，在生物醫學領域，能產生雙折光性的物質有纖維(如膠原纖維、肌纖維、彈性纖維)、紡錘體、骨頭、牙齒等。實驗研究中通常利用偏振光技術來觀察具有雙折光特性的物質，其可揭示從而探討這類物質在生物體生理、病理狀態下結構與功能發生的改變。

膠原纖維是具有雙折光性的物質，Puchtler等最先發現以天狼猩紅溶解于飽和脂肪酸溶液中，可以使膠原纖維特異性持續染色，且不易褪色，在偏振光顯微鏡下染色之后的膠原纖維清晰可辨［2］。然而這種方法對膠原纖維的檢測有著很大的局限:傳統偏振光顯微鏡采用兩片正交偏振光片，其呈現原理為線偏振，當纖維排列方向與兩塊偏振光片的某一透射軸平行時，經天狼猩紅染色后的纖維在視野中就無法被觀察到。雖然通過改變組織切片的方向可以減小這種弊端，但是纖維的形態通常是有褶皺的，甚至為波浪狀的，即使旋轉載物臺，某些部分的纖維依然不可見，從而導致假陰性結果。采用圓偏振光照明可彌補線偏振光照明的不足，無論雙折射的物質取向如何，在視野中均清晰可見［3］。

Abrio液晶偏光影像系統由美國CRi公司研發，采用LC-PolScope核心技術，其特有的液晶補償光學元件可以將偏振光波產生的光程差信號轉變為電信號，再通過軟件在監測器上還原成明暗不同的光信號。Abrio在傳統線形偏振光片的基礎上，加裝了四分之一濾波片，構成了CP/IF(circular polarizer and interference filter)組件，光波通過該組件時產生單色的近似圓偏振光，從而彌補了線偏振光光軸方向的局限。較傳統偏振光顯微鏡最大的不同是:在組織未經染色的狀態下，Abrio不僅可以對具有雙折射的物質進行定性觀測，同樣可以對雙折射的強度和方向進行定量分析。除此之外，Abrio特有的液晶補償器替代了傳統光學補償器，從而實現了對雙折光性物質高靈敏度的成像。Abrio目前已應用于羽毛中的角蛋白［4］、活細胞分裂過程中的紡錘體［5］、神經細胞突觸發育過程［6］等方面的研究，但在心血管系統的研究中還未見應用。

本研究中，我們建立了衰老大鼠動物模型，選取青年大鼠和衰老大鼠胸主動脈為研究對象，未經染色狀態下應用Abrio液晶偏光影像系統觀察青年與衰老大鼠主動脈纖維結構的差異，而后對主動脈進行苦味酸天狼猩紅染色，對比觀察傳統偏振光與Abrio對主動脈纖維結構成像的差異，探討生物組織偏振光學特征測量的優勢和特色，為其在生物醫學領域中的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠20月齡7只(衰老組)，2月齡7只(青年組)。動物級別:二級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。常規飼養一周后進行手術。

1.2 主要試劑

苦味酸天狼猩紅染液(雪邦科技有限公司)，戊二醛(上?；瘜W試劑采購供應站)，中性福爾馬林溶液(北京化工廠)，二甲苯(北京化工廠)，石蠟(北京化工廠)，酒精(北京化工廠)。

1.3 實驗設備

組織切片機(Thermo 77500101，英國)，烘片機(Thermo 3120061，英國)，漂片儀(Thermo 3120059 Round Bath，英國)，倒置顯微鏡(Nikon TE2000，日本)，液晶偏光影像系統(CRi Abrio，美國)，偏光顯微鏡:光學顯微鏡(OLYMPUS BX51，日本)。

1.4 實驗方法

主動脈切片的制備:5 mg/mL戊二醛麻醉，處死動物并留取標本:開胸，輕柔分離胸主動脈降段(沿主動脈出口水平至膈肌入口處)，0.9%NaCl溶液沖洗血管內殘存血液，濾紙吸干，取主動脈出口端0～3 mm處血管，10%中性福爾馬林溶液固定24 h后，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，從近心端血管橫斷面開始制作石蠟切片，片厚4 μm。

天狼猩紅染色:Abrio拍照后的切片置于－4℃冰箱保存，隔日進行苦味酸天狼猩紅染色:切片常規至水后，0.1%苦味酸天狼猩紅染液染色，90 min后終止染色，清水漂洗數次并常規脫水、透明、中性樹膠封片。

觀察:主動脈切片制備完成后，常規脫蠟，不染色條件下在普通光學顯微鏡下、傳統偏振光顯微鏡下、Abrio液晶偏振光顯微鏡下分別觀察主動脈結構并拍照。結合圖像分析軟件，對Abrio拍照后的圖像進行雙折射方向的定性及定量分析。

天狼猩紅染色后的切片在傳統線偏光顯微鏡下找到未染色時Abrio拍照的相同部位，對染色后的切片再次進行拍照，對比Abrio圓偏振和傳統線偏振技術成像特點的差別，并對染色后青年、衰老大鼠主動脈的Abrio圖像進行光程差的定量分析。

1.5 統計方法

采用SPSS13.0軟件進行統計處理，對分組變量進行獨立樣本t檢驗，各指標以均數±標準差±s)表示，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 Abrio液晶偏光影像技術觀察未經染色的青年大鼠、衰老大鼠主動脈纖維結構

如圖1所示，未經染色的主動脈組織切片在普通光學顯微鏡下(圖1A，圖1B)、傳統偏振光顯微鏡下(圖1C，圖1D)、Abrio液晶偏振光顯微鏡下(圖1E，圖1F)可見:具有雙折光性的纖維在Abrio偏振光顯微鏡下清晰可見，在傳統偏振光顯微鏡下呈像靈敏度差，強度低，與背景不易分辨，而在普通顯微鏡下則無法對纖維進行成像。青年(圖1E)和衰老大鼠(圖1F)主動脈的Abrio圖像清晰顯示:衰老大鼠較青年大鼠血管壁增厚，血管外膜結締組織增多，以纖維組織增多為主，且分布更為致密，外膜明顯增厚，增多的纖維條索狀結構明顯(箭頭所示)。青年大鼠主動脈全層均有較強的雙折射，多層彈性膜清晰可見;衰老大鼠主動脈內彈性膜和外彈性膜信號雙折射較強，但兩層彈性膜之間的中膜雙折射信號較青年組明顯減弱，層狀彈性膜結構也變得模糊不清。

圖1 普通光學顯微鏡下、傳統偏振光顯微鏡下、Abrio液晶偏光顯微鏡下未經染色的大鼠胸主動脈×200Fig.1 Unstained thoracic aorta of rats under ordinary optical microscope，traditional polarizing microscope and Abrio imaging system×200

圖2為利用Abrio圖像分析軟件自帶的方向偽彩(圖2A、圖2C)和矢量標注(圖2B、圖2D)功能，對圖1中(圖1E、圖1F)主動脈雙折射方向特征進行定性分析。該功能可將圖像中雙折射同一方向的結構按同一顏色或同一方向的矢量標注出來。根據圖像可見，青年大鼠主動脈纖維呈環向分布，數層彈性膜顏色分布較均勻(圖2A)，纖維狀結構的矢量方向較整齊(圖2B)。而衰老大鼠主動脈的內、外彈性膜中的雙折射明顯強于二者之間其他各層彈性膜，顏色深，纖維在內、外彈性膜中保持環狀排列(圖2C)，矢量圖中(圖2D)動脈中膜靠近內膜一側的分子矢量方向較不規則。對于外膜膠原纖維，因其空間上為三維分布，其排列方向隨增齡的變化規律還有待進一步研究證實。

圖2 未經染色的主動脈Abrio雙折光信號方向特征的定性分析 ×200Fig.2 The qualitative analysis of orientation of birefringence signals of undyed thoracic aorta，using Abrio imaging system×200

為了進一步探討纖維排列方向在大鼠衰老過程中的變化，本實驗又對青年與衰老大鼠Abrio圖像的雙折射信號進行了方位角的定量研究。為了排除圖片中管壁方向的影響，用軟件自帶的直線掃描功能畫一條與管壁方向垂直、貫穿中膜和內膜全層的直線(圖3A)，軟件可自動對這條直線上雙折射的方位角(Azimuth)進行定量測量(方位角測量自動將0°-180°計為有效值，圖3B)。為了衡量該條直線上雙折射方向的變化，我們選擇方位角的標準差進行記錄(圖3C)。同一張照片上我們再隨機畫出4條直線，對這5條直線所記錄的標準差取平均值，得到該張圖片的5條隨機選取的直線上從血管內膜到中膜方位角變異程度的平均值，依照此方法完成其余青年和衰老組大鼠主動脈圖像中方位角變異程度的平均值的記錄，并將平均值作為統計檢驗量，進行統計分析，比較雙折射方向的變異程度在青年大鼠與衰老大鼠主動脈中的差別，以此評價隨著大鼠的衰老，纖維排列方向發生的改變。結果表明(表1):青年組大鼠胸主動脈雙折射方位角的變異程度明顯小于衰老組，證明隨著增齡，大鼠胸主動脈纖維排列方向發生一定程度的紊亂。

圖3 未染色主動脈偏振光信號方位角的定量分析Fig.3 The quantitative analysis of azimuth of birefringence signals of undyed thoracic aorta，using Abrio imaging system×200

2.2 苦味酸天狼猩紅染色后分別采用傳統偏振光和Abrio液晶偏振光技術觀察大鼠胸主動脈

如圖4所示:經苦味酸天狼猩紅特異性染色后的膠原纖維主要集中于主動脈外膜，旋轉線偏振光裝置的起偏器于合適位置(圖4A，圖4B)，根據纖維的雙折光性強弱，可見信號表達呈現出顏色上的差別。較粗大的纖維折光性強，呈現紅色或橙黃色;較細小的纖維折光性弱，呈現綠色。被染成紅色的纖維呈條索狀，數量多且清晰可見;被染成綠色的纖維散布在紅色纖維周圍，表達較少且不易分辨。線偏光顯微鏡下主動脈中膜和內膜幾乎不見偏光信號。采用Abrio液晶偏振光技術觀察染色后的主動脈(圖4C，圖4D)，可見外膜纖維雙折射信號表達位置較圖4A、圖4B更加完整，血管外膜膠原雙折射信號強，中膜和內膜也有雙折射信號，但較外膜弱，衰老組中膜和內膜膠原纖維雙折射較青年組明顯增強。

圖4 主動脈苦味酸天狼猩紅染色后傳統線偏振光和Abrio液晶偏振光圖像 ×200Fig.4 Thoracic aorta of rats under traditional polarizing microscope and Abrio imaging system after being stained with picric-sirius red×200

用Abiro系統軟件自帶功能對Abrio圓偏振圖像中青年和衰老大鼠胸主動脈膠原纖維的光程差和外膜膠原纖維層厚度進行定量，結果表明(表2):衰老大鼠較青年大鼠主動脈纖維的雙折射光程差增大，外膜膠原纖維層厚度明顯增厚。說明隨著增齡，衰老大鼠主動脈纖維結構的雙折光性增強，膠原纖維增多，外膜增厚。

表1 大鼠胸主動脈雙折射方位角的變異程度Tab.1 The azimuth variation of birefringence of thoracic aorta

表2 胸主動脈膠原纖維平均光程差與外膜纖維層厚度Tab.2 The retardance of collagen fibers and the thickness of fiber layer of thoracic aorta

3 討論

對于大動脈血管來說，纖維結構既是維持血管結構的組成部分，同時，又在承受力量負荷中發揮重要作用。健康人動脈分為三層:內膜、中膜和外膜。內膜主要由單層內皮細胞構成，另外還有一層很薄的結締組織，即內皮下層。內皮下層中含有少量的膠原纖維和彈性纖維，有的動脈在內皮下層和中膜之間還有一層內彈性膜。大動脈的中膜主要以彈性膜為主，間有少許平滑肌細胞。平滑肌細胞可產生膠原纖維、彈性纖維和基質，因其形狀細長，呈纖維狀，也稱為平滑肌纖維。外膜主要為疏松結締組織構成，其中含有膠原纖維和彈性纖維，在有的動脈中膜和外膜的交界處，有密集的彈性纖維組成的外彈性膜。血管中的纖維結構對血管的結構和功能起到重要的作用，膠原纖維決定血管的張力強度，彈性纖維決定血管的彈力性能［7］。隨著年齡增加，血管壁增厚，膠原纖維增多，管壁僵硬度增加;反之，彈性纖維隨著增齡而減少，其間彈性蛋白斷裂、崩解成碎片，動脈彈性因而降低。與此同時，平滑肌細胞增殖、遷移，纖維收縮功能減弱。正因為纖維成分在血管的結構和功能中具有上述極為重要的作用，因此，對于纖維的觀察與檢測一直以來作為評估血管生理病理狀態的一項重要標準。

血管壁中的膠原纖維、彈性纖維和平滑肌纖維都具有雙折光性［8，9，13］，因此，Abrio 液晶偏光圖像中這三種纖維均有雙折射信號表達。膠原纖維主要分布于血管外膜，可由外膜成纖維細胞大量分泌［10，11］;彈性纖維在血管中膜、內外彈性膜中大量分布，主要由血管平滑肌細胞分泌［12］。對比觀察青年大鼠和老年大鼠主動脈纖維結構，可見隨著增齡，大鼠胸主動脈管壁增厚，外膜膠原纖維增多。更有特點的是圖像中可見增齡大鼠較青年大鼠內、外彈力膜增厚，雙折射增強，這可能是增齡導致的血管老化、管壁承受的壓力增高所引起的代償性反應。相反，增齡大鼠中膜信號減弱，層狀彈力膜結構不清，分析這種現象，增齡引起的彈性纖維減少，彈性蛋白斷裂、崩解可能是其最直接的原因。運用Abrio自帶的雙折射方向的定性與定量分析功能可以得出，隨著大鼠的增齡，纖維的雙折射方向發生紊亂，這可能是由增齡導致的內皮細胞功能紊亂，血管壁結構損傷，平滑肌細胞向內膜方向移動，彈性蛋白斷裂所引起的 。Abrio液晶偏光影像技術可以實現在未經染色的情況下，對生物組織雙折射的值和方向進行定量觀察和測量，而普通光學顯微鏡和傳統偏光顯微鏡在未經染色的情況下對血管的成像不清晰，且無法定量反映纖維的結構與分布情況。用苦味酸天狼猩紅對膠原纖維進行特異性染色，其原理是膠原含有大量的堿性氨基酸基團，與苦味酸天狼猩紅陰離子結合后，染料分子以在長軸方向彼此平行排列的方式附著于每個膠原分子，從而使膠原的雙折光性明顯增強［13，14］。所以在 Abrio顯微鏡下，染色后的圖像(圖4.C、圖4.D)與未染色的圖像(圖 1.E、圖 1.F)相比，血管外膜膠原纖維雙折射大大增強，中膜其他物質的雙折射則相對變弱，從而實現了對膠原纖維的獨立成像。傳統線偏振光結合苦味酸天狼猩紅染色觀察膠原纖維也是利用了這個原理。然而，對比Abrio的偏振光圖像和線偏振光成像結果不難發現，Abrio產生的近似圓偏振光圖像明顯比線偏振光對于膠原的分布和形態反映的更加清晰、完整，這是由于膠原纖維形態卷曲，甚至呈波浪狀，一部分纖維的排列方向與兩塊偏振光透射軸均平行，線偏振光顯微鏡下無法觀測到這些纖維。反之，圓偏振光則不受纖維排列方向的局限，使所有被特異性染色的膠原纖維得以成像。不僅如此，以往的研究多采用線偏振光結合天狼猩紅染色技術來區分組織中的I型與III型膠原，該種方法認為染色后的膠原在線偏振光作用下，呈現紅色和黃色信號的纖維偏光作用強，為I型膠原;呈現綠色信號的纖維偏光作用弱，為III型膠原［15，16］。然而在實際操作過程中我們發現，這種區分方法有很大的局限:即旋轉起偏器，使起偏器透射軸方向發生改變，可見圖像中纖維數量、強度和紅綠纖維比發生很大改變。近些年越來越多的研究者也開始質疑:雖然III型膠原多數較I型膠原細小，但是，除了III型膠原外，不成熟的或者是較細小的I型膠原也可產生綠色信號，所以測量目前不足以用來區分I型與III型膠原［3］。Abrio圖像中我們還發現，血管中膜也有雙折射，只是較外膜弱，而線偏振光下不見中膜顯示偏振信號表達。分析這種現象，實際上血管中膜的平滑肌細胞也可分泌少量的膠原纖維，所以不僅在血管外膜，中膜也應有一定的雙折射，且隨著大鼠的增齡，中膜中的膠原纖維分泌增多，管壁硬化。因此，Abrio的成像較傳統偏振光成像更符合血管的生理結構，得到的圖像具有更高的可信性。Abrio液晶圓偏光影像技術還可實現對雙折射信號光程差的定量分析，本實驗中衰老組大鼠胸主動脈膠原纖維雙折射的光程差較青年組明顯增大，這說明隨著大鼠的增齡，主動脈中膠原纖維增多，外膜增厚。由此可見，Abrio液晶偏光影像系統在組織雙折光性強弱的判斷上，同樣優于其它偏光影像技術，在進一步的實驗研究中，我們將用該方法進行I、III型膠原判定，以拓展其應用面。

綜上所述，本實驗將Abrio液晶偏光影像技術應用于大鼠胸主動脈纖維結構的觀察，認為該技術對具有雙折光性物質的研究具有以下優勢:圓偏振光片使顯像較線偏振光片更加精確，完整;獨有的液晶光學補償器可實現高靈敏度成像;非侵入性，不用熒光染料或染色劑，避免對組織造成傷害;結合圖像分析軟件可以進行雙折光強弱和方向的定性與定量分析;方便易用等。因此，定量偏振光影像技術在未來生物醫藥領域的研究中定會體現更大的價值。

［1］BROMAGE T G，GOLDMAN H M，MCFARLIN S C，et al.Circularly polarize light standards for investigations of collagen fiber orientation in bone［J］.Anat Rec B New ANAT，2003，274(1):157-168.

［2］SWEAT F，PUCHTLER H，ROSENTHAL S I.Sirius red F3BA as a stain for connective tissue［J］.Arch Pathol，1964，78:69-72.

［3］RICH L，WHITTAKER P.Collagen and picrosirius red staining:a polarized light assessment of fibrillar hue and spatial dis-tribution［J］.Braz J Morphol Sci，2005，22(2):97-104.

［4］PABISCH S，PUCHEGGER S，KIRCHNER H O，et al.Keratin homogenity in the tail feathers of Pavo cristatus and Pavo cristatus mut.alba［J］.Jornal of Structural Biology，2010，172(3):270-275.

［5］MORIMTO A，MATSUNAGA S，KURIHARA D，et al.Vissualization of mitotic HeLa cells by advanced polarized light microscopy［J］.Micron，2008，39(5):635-638.

［6］KATOH K，HAMMAR K，SMITH P J，et al.Briefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones ［J］.Mol Biol Cell，1999，10(1):197-210.

［7］TSAMIS A，KRAWIEC J T，VORP D A.Elastin and collagen fiber microstructure of the human aorta in aging and disease:a review［J］.J R Soc Interface，2013，10(83):20121004.

［8］NADKARNI S K，PIERCE M C，PARK B H，et al.Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography［J］.J Am Coll Cardiol，2007，49(13):1474-1481.

［9］SANDBERG L B，SOSKEL N T，LESLIE J G.Elastin structure，biosynthesis，and relation to disease states［J］.N Engl J Med.1981，304(10):566-579.

［10］FUSCO D，COLLOCA G，LO MONACO M R，et al.Effects of antioxidant supplementation on the aging process［J］.Clin Interv Aging，2007，2(3):377-387.

［11］王洋.益氣活血中藥通過外膜干預血管衰老及血管衰老的中醫證型特點研究［D］.中國中醫科學院.2012.WANG Yang.The study of treating vascular aging with traditional Chinese medicine of tonifying Qi and activating blood from adventitia and the corresponding syndrome type research［D］.China Academy of Chinese Medical Sciences.2012.

［12］ROSS R.The smooth muscle cell II Growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers［J］.J Cell Biol，1971，50(1):172-186.

［13］張晶，何靜雯，王泰齡，等.苦味酸天狼猩紅偏振光法鑒別I型及III型膠原纖維［J］.中華病理學雜志，1996，25(3):180-181.

［14］沈薔，陳莉，李昊，等.苦味酸-天狼猩紅染色和MASSON染色評價心臟纖維化的比較［J］.中國分子心臟病學雜志.2012，12(2):118-120.SHEN Qiang，CHEN Li，LI Hao，et al.Comparison of Picric Sirius red staining and MASSON staining in evaluaation of cardiac fibrosis［J］.Melecular Cardiology of China.2012，12(2):118-120.

［15］WU G，HE X，AN Y，et al.Effect of continuous elastic outside distribution on change of collagen content in female minipig＇s nipples and their supporting tissues［J］.Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery，2010，24(12):1510-1514.

［16］李輝，唐康來，鄧銀栓，等.外源性前列腺素E2對兔跟腱膠原含量的影響［J］.中國修復重建外科雜志，2012，26(3):352-358.LI Hui，TANG Kanglai，DENG Yinshuan，et al.Effects of exogenous prostaglandin E2 on collagen content of Achilles tendon of rabbits in vivo［J］.Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery，2012，26(3):352-358.