遠端霉素高產菌株的選育＊

蔣世春，金洪順，樓惠琴，白 驊

(浙江海正藥業股份有限公司，浙江 臺州 318000)

遠端霉素是抗病毒和抗原生動物活性的新型低聚肽類抗生素，其衍生物可作為細胞毒試劑，用于抗腫瘤治療［1］。該產品具有較高的臨床應用價值，但國內研究甚少，主要來自進口。由于國內遠端霉素產生菌發酵單位低，工藝不完善，制約產業化［2］，為了結束長期依賴進口歷史，打造國產品牌，因此，開展遠端霉素產生菌選育，提高發酵生產水平，降低成本，實現國產化，增強國際市場競爭力，具有十分重要意義。激光誘變是一種新型的誘變育種新技術，具有能量密度高，靶點小，單色性和方向性好等特點，因此在工業微生物育種中得到廣泛的應用。作者已報道了天藍淡紅鏈霉菌激光高產株選育實驗結果［3，4］。應用 5-氟尿嘧啶選育微生物，文獻已有報道［5］，但二者復合誘變選育尚未報道。本文首次報道了銅蒸汽激光與5-氟尿嘧啶(5-fu)復合選育遠端霉素高產株的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 出發菌株

遠端霉素生產菌——司他鏈霉菌(Streptomyces distallicus)

1.2 培養基(%)及培養條件

1.2.1 斜面與分離培養基(%)及培養條件 可溶性淀粉 2，酵母粉 0.5，K2HPO40.05，瓊脂粉 2.5，PH自然，28±1℃培養8-10天。

1.2.2 種子培養基(%)及培養條件 葡萄糖3，玉米漿干粉 2，酵母粉 0.3，GaCO30.3，K2HPO40.1，28±1℃，220 r/min搖床振蕩培養2天。

1.2.3 發酵培養基(%)及培養條件 糊精4，玉米粉 2，黃豆餅粉 2，蛋白胨 0.5，CaCO30.4，NaCL 0.3，接種量10%，28±1 ℃，220 r/min搖床振蕩培養6-7天。

1.3 誘變處理及篩選方法

1.3.1 誘變處理及篩選方法 銅蒸氣激光選用功率約8 W，輻照時間4 min。

1.3.2 含50 r/mL的5-氟尿嘧啶平血的制備 稱一定量的5-氟尿嘧啶精品，加入已滅菌的分離培養基中，使之最終濃度達50 r/mL，然后倒皿，凝固，待用。

1.3.3 單孢子懸浮液的制備 將培養成熟的新鮮斜面加入約10 mL生理鹽水(含0.85%NaCL)，刮下孢子，分散過濾，得單孢子懸浮液，待用。

1.3.4 稀釋、分離 將上述各樣品，進行適當稀釋、分離，以未經任何處理的孢子液進行自然分離作對照組。

1.3.5 平皿的培養及單菌落斜面的篩選 將上述平皿置28±1℃的恒溫培養箱培養7天，待長成熟后，挑單菌落接斜面，最后進搖瓶試驗，測遠端霉素效價。

1.4 遠端霉素效價(單位)測定方法

發酵液用80%乙醇浸泡，離心，取上清液進行HPLC色譜法測定。流動相:溶劑A:乙腈，溶劑B:含水的十二烷基硫酸鈉溶液12 g/L加上12 mL 85%的磷酸，流速為0.25 mL/min，檢測波長為304 nm。

2 結果與討論

2.1 誘變劑Laser與5-fu對遠端霉素產生菌致死率的影響。

實驗結果表明:用Laser輻照4分鐘與5-fu、50 r/mL單一誘變遠端霉素產生菌的致死率分別為83.2%、90.6%，而兩者復合誘變，其致死率為 98.9%，見圖1，并在復合誘變組中獲得一株遠端霉素高產株，表明復合選育效果優于單一誘變效果。

圖1 致死率曲線Fig.1 Death curve

2.2 誘變劑Laser與5-fu對遠端霉素產生菌的菌落類型的影響

遠端霉素產生菌經Laser、5-fu及其復合處理后，增加了平坦型和半光禿型兩種新的菌落類型，經生產能力考察，其效價分別為饅頭型(正常型)菌落效價的62%與67%，而車輪型菌落效價約為正常型的75%，其比例關系見表1，從表1可知，高劑量復合誘變組中出現雜合菌落總數比例高于任一單一誘變組，而自然分離組卻沒有出現新的雜合菌落類型。

表1 菌落類型與比例Tab.1 Colong type and percentage

2.3 誘變劑Laser與5-fu對遠端霉素產生菌抗生素產量的影響

遠端霉素產生菌經Laser與5-fu及其復合誘變后，其產量正突變頻率分別為32.5%，和50%，而對照組為20%，見圖2，從圖2可知，復合誘變組的正突變率為最高，而且獲得一株高產突變株其產量比對照株穩增1.36倍，而單一誘變組正突變率均比對照組高，且突變株的產量增幅在100-120%范圍內，收到了顯著的誘變效果。

2.4 高產突變株的遺傳特性考察及應用

高產突變株經遺傳穩定性考察連續傳代F1至F4，其發酵單位保持穩定，結果見圖3。經發酵罐應用后，平均發酵單位比對照株提高1.38倍，其代謝曲線見圖4，表明該菌株適合于工業化大生產要求，是一株高產穩產的優質菌株。

圖2 突變株產量分布(%)Fig.2 Distribution of antibiotic production of variants

圖3 高產株遺傳穩定性考察Fig.3 The productivity of each generation of high-producing strain

2.5 高產突變株的產量提高穩定性考察

表2 高產株的產量穩定性Tab.2 Fermentation potency of High-producing strain

從表2可知，高產菌株經過連續四批的產量穩定性考察，其高產性能經久不衰，比出發菌株的發酵效價穩增138%，相當于產量翻了1.38倍，大大提高了生產水平，降低了生產成本，給企業帶來了顯著的經濟效益。

圖4 發酵代謝曲線Fig.4 Metabolic activity of fermentation

目前抗生素工業生產菌種的選育主要方法有傳統的理化誘變和基因工程技術，后者選育必須要透徹研究其生物合成途徑，難度大，時間長，操作繁瑣，成功率低，風險較大，應用性受到局限，但它可作為新抗生素來源的手段之一。而采用前者的傳統理化誘變方法，往往以采用單一因素誘變處理為主，即使采用復合誘變，其產量提高幅度不寬，效果不顯著，本課題首次研究了銅蒸汽激光與5氟嘧啶復合處理遠端霉素產生菌，收到顯著的選育效果，并且該方法可以快速有效地獲得較理想的抗生素高產株，具有較高的實用價值，為今后篩選其它抗生素高產菌株提供借鑒，拓寬了它在制藥生物工程中的應用前景。

［1］ C.弗奧斯特 F.福里蘭德 M..C.R.戈羅尼.包括遠端霉素衍生物的抗腫瘤療法.意大利:CN1468099A，2014.

［2］OGAWA H，YAMASHITA Y，KATAHIRA R，et al.UCH9，a new antitumor antibiotic produced by Streptomyces:I producing organism，fermentation，isolation and biological activities［J］.J Antibiotics，1998，51(3):261-266.

［3］吳振倡，王鳳仙，蔣世春，等.天蘭淡紅鏈霉菌(S.coeruleorubidus)激光高產株的選育［J］.激光生物學報，1996，5(1):797-799.WU Zhenchang，WANG Fengxian，JIANG Shichun，et al.Selection of laser-high-producing strain in Streptomyces coeruleorubidus［J］.Laser Biology，1996，5(1):797-799.

［4］王鳳仙，吳振倡，郭紅櫻，等.天蘭淡紅鏈霉菌原生質體再生株激光輻照的研究［J］.激光生物學報，1998，7(1):32-33，56 WANG Fengxian，WU Zhenchang，GUO Hongying，et al.Study of radiation in the regeneration strain of the protoplast for S.coruleorubidus with the laster［J］.Laster Biology，1998，7(1):32-33，56.

［5］劉輝，張慶慶，呂聞聞.復合誘變選育高產γ-氨基丁酸菌株［J］，安徽工程大學學報，2011，26(3):211-213.LIU Hui，ZHANG Qingqing，LV Wenwen.Compund mutation screening of γ-aminobutyric acid high-yield strain ［J］.Journal of Anhui Polytechnic University，2011，26(3):211-213.