生物傳感器法測定麥芽汁中賴氨酸含量的研究＊

馮 東，王丙蓮

(1.山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250014;2.山東省科學院生態研究所，山東 濟南 250014;3.山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

大麥含各種必需氨基酸，而賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸含量較低，為大麥的限制性氨基酸。而賴氨酸作為蛋白質的第一限制氨基酸，其含量是判定大麥優質品種與否的一個重要指標。大麥麥芽汁是啤酒生產的主要原料，其成分分析對于啤酒生產工藝研究具有重要意義。研究報導麥芽汁中的游離氨基酸是影響酵母細胞生長和發酵的重要指標，賴氨酸和蛋氨酸是麥芽汁發酵中的關健氨基酸，補加賴氨酸對酵母發酵水平及酵母發酵對氨基酸的利用的影響非常明顯［1］。因此，測定麥芽汁中的賴氨酸含量，對啤酒生產有重要的指導作用。隨著氨基酸自動分析儀的問世，氨基酸測定技術已發展到進樣、分離、檢測和數據處理全部自動化的程度。但大批量樣品的賴氨酸含量測定受時間、經費或儀器設備條件限制。本研究中，我們采用賴氨酸生物傳感分析儀測定麥芽汁中的賴氨酸含量，并對其的準確性和穩定性進行了評估，結果表明該生物傳感器能夠快速、準確的測定麥芽汁中賴氨酸含量，從而為賴氨酸含量檢測提供一種快速、有效的方法，為麥芽汁做原料的酵母的高效發酵提供技術服務。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

賴氨酸氧化酶，美國Sigma公司;賴氨酸:美國Sigma公司;牛血清蛋白(BSA Sigma進口分裝)、戊二醛:日本酵母工業株式會社，其他試劑均為分析純。

SBA-40E型生物傳感分析儀:山東省科學院生物研究所研制

1.2 實驗原理

賴氨酸氧化酶酶膜安裝于生物傳感分析儀(SBA-40E)，分析儀反應池側面裝有過氧化氫電極。定量的賴氨酸樣品溶液注入反應池后，有下列酶反應進行:賴氨酸+O2+H2O6-氨基-2-氧代己酸+H2O2+NH3

在一定時間內，產生的H2O2量與賴氨酸的含量成正比，由過氧化氫電極產生相應的電流信號，在生物傳感分析儀的屏幕上以數字顯示并自動記錄和打印，顯示值和賴氨酸含量有線性關系。

1.3 測定方法

1.3.1 賴氨酸氧化酶酶膜制備 采用美國Sigma公司的賴氨酸氧化酶，采用酶固定化技術加工制成賴氨酸酶膜［2］，靜置干燥，備用。

1.3.2 賴氨酸梯度濃度配制 準確稱量賴氨酸分別溶于蒸餾水，配制濃度依次為 0、1、2、3、4、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg/100 mL梯度濃度賴氨酸溶液，靜置備用。

1.3.3 標準曲線的繪制 將賴氨酸氧化酶酶膜安裝于SBA-40E型生物傳感分析儀，依據分析儀的操作步驟，以精確配制的100 mg/100 mL賴氨酸溶液對分析儀進行標定，并依次檢測梯度濃度賴氨酸溶液，每個濃度重復3次。以賴氨酸溶液濃度為橫坐標，賴氨酸氧化酶相對酶活性為縱坐標，繪制標準曲線，檢驗賴氨酸氧化酶對賴氨酸的線性響應規律及檢測限。

1.3.4 麥芽汁樣品處理及測定 以18°P的原麥芽汁為待測樣品，取一定量的麥芽汁于5000 r/min離心5 min，取其上清液以濾紙過濾，濾液用蒸餾水按相應比例稀釋，后依據分析儀提示準確吸取25 μL稀釋液注入反應池。20 s后分析儀自動顯示并打印結果，結合稀釋倍數即可分析麥芽汁中賴氨酸含量。

2 結果與分析

2.1 線性范圍及檢出限確定

賴氨酸氧化酶相對酶活性對賴氨酸含量的響應曲線見圖1(A，B)。由圖1(A)可知，賴氨酸濃度在0-200 mg/100 mL范圍內，賴氨酸氧化酶活性與賴氨酸濃度線性關系較差，其回歸方程為:Y=94.93785+14.03916X，相關系數 R2=0.97203。以 2、3、4、5、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL 賴氨酸濃度繪制工作曲線圖1(B)，賴氨酸氧化酶活性與賴氨酸濃度相關系數R2=0.9995，二者呈良好線性關系。由此可認為，基于賴氨酸氧化酶活性原理的生物傳感器法檢測賴氨酸的線性范圍為2～100 mg/100 mL，檢出限為2 mg/100 mL。

2.2 專一性試驗

麥芽汁中含有20種基本氨基酸中的19種，這些氨基酸的降解有序并基于一定的模式，氨基酸按著酵母的同化方式可分為四類(見表1)［3］。

取麥芽汁中共存的幾種游離氨基酸，以及葡萄糖、乳酸等作為干擾物，驗證生物傳感器法(SBA-40E)檢測賴氨酸含量的專一性和抗干擾能力。配制谷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、葡萄糖、L-乳酸、2，3-戊二酮等干擾濃度為 100 mg/100 mL，以濃度為100 mg/100 mL的賴氨酸標準溶液作對比，分別重復測試4次，結果見表2。

圖1 賴氨酸氧化酶活性與賴氨酸濃度的線性關系Fig.1 Linear relationship between the activity of lysine oxidase and lysine concentration

表1 以酵母同化速率為依據的麥芽汁中氨基酸分類Tab.1 Classification of amino acids in wort on the base of the yeast assimilation rate

表2 專一性試驗(n=4)Tab.2 Specificity test for lysine

由表2可以看出，基于固定化賴氨酸氧化酶的生物傳感分析儀能夠準確檢測到賴氨酸濃度，而對其它共存于麥芽汁中的氨基酸等均無明顯響應，說明該傳感器法的對賴氨酸的檢測專一性很高。能夠有效排除麥芽汁中共存的亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸等具有相近化學顯色反應物質的干擾，確保其測定準確性和精確性［4］。

2.3 最適反應pH試驗

不同pH值的測定環境對賴氨酸氧化酶的催化活性、穩定性及壽命均有影響，從而影響賴氨酸含量的測定。本實驗選用 pH 值為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12的 0.2 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，以 100 mg/100 mL賴氨酸溶液作為反應底物，檢驗賴氨酸酶膜催化反應的的最適pH值，及不同pH值環境中酶膜壽命，結果如圖2(A、B)。pH 6～8時賴氨酸氧化酶催化活性較高，而pH 7時酶活性最高(圖2 A)，且pH7的緩沖液中賴氨酸氧化酶酶膜壽命較長，工作40 d時酶活性降低不明顯(圖2 B)，而酸堿環境中酶膜活性明顯降低，甚至失活。綜上，本測定系統的最適反應 pH值7.0。

2.4 加標回收率試驗

準確稱取分析純賴氨酸1.55 g，蒸餾水定容至100 mL，配制賴氨酸質量濃度為15.5 mg/mL。利用賴氨酸生物傳感分析儀(SBA-40E)進行含量測定，重復5次，依據空白加標回收率計算公式:P=(測定值÷理論值)×100%，結果見表3。結果表明該方法測定賴氨酸含量的回收率良好，準確度較高。

表3 回收實驗Tab.3 Recovery experiment for lysine

圖2 pH值對賴氨酸氧化酶酶膜活性(A)及酶膜壽命(B)的影響Fig.2 Effect of pH on the activity(A)and life(B)of lysine oxidase membrane

2.5 生物傳感器法與其他測定方法對比試驗

為了確定生物傳感器法與氨基酸分析儀法、染料結合法(DBL法國標GB4801-4)、液相色譜方法測定結果是否有較大差異，我們取2個麥芽汁樣品(a、b)，每個樣品分別用生物傳感分析儀(SBA-40E)、氨基酸分析儀、高效液相色譜(HPLC)、DBL法進行檢測，每個測定重復6次，分別于SBA-40E比較，結果進行顯著性t檢驗，數據見表4。

表4 對比試驗(mg/100 mL)Tab.4 Comparative test between biosensor and amino acid analyzer，DBL，HPLC

由以上結果可以看出，對于2個麥芽汁中賴氨酸含量的測定，生物傳感器法測定結果與氨基酸分析儀、高效液相色譜儀及燃料結合法(DBL)相比較均無顯著差異(P＞0.05)。與氨基酸分析儀及DBL法相較而言，SBA-40E法與HPLC法的相對標準偏差(RSD)均較低，說明采用生物傳感器法測定麥芽汁中賴氨酸含量，準確度高、穩定性好，相較于高效液相色譜的昂貴費用，以及復雜操作，更適用于以麥芽汁為原料的啤酒等實際生產的定量及實時監控。

3 討論

麥芽汁中的游離氨基氮(FAN)對酵母細胞的生長和發酵有重要影響，在啤酒發酵初期，啤酒酵母必須通過吸收麥芽汁中的含氮化合物合成酵母細胞蛋白質。不同的氮源組成，不僅對酵母增殖有顯著的影響，而且對酵母的代謝、各類風味副產物的形成有重要影響，其代謝產物直接決定啤酒的獨特風味［5］。釀造麥芽汁中含有19種氨基酸，賴氨酸作為必需氨基酸，其水平可直接影響啤酒的發酵，是麥汁中的“標志性”氨基酸［6］。

目前，國內外賴氨酸含量測定主要采用化學分析法和儀器分析法。化學分析法主要有染料結合法(DBL 法，國標 GB48014)［7］和茚三酮比色法［8］。DBL法測定賴氨酸含量的經典方法，但需要配套蛋白質分析儀或賴氨酸分析儀，這類分析儀器由于使用率低、使用范圍窄、操作易出故障等原因，現在已少有廠家生產。茚三酮比色法(分光光度法)測定氨基酸簡便易行，多用于學生實驗課教學［9］。但使用茚三酮法測定賴氨酸含量時，因亮氨酸、異亮氨酸均與賴氨酸有相近的游離氨基，故底物中的亮氨酸、異亮氨酸均嚴重影響賴氨酸含量測定的準確性［10］。

儀器分析法主要有氨基酸分析儀分析法［11］和高效液相色譜法［12-13］。儀器分析法測定賴氨酸含量具有穩定性好、精度高等優勢，但是儀器分析操作復雜、費用昂貴，且對樣品前處理前處理要求高。儀器分析是一項復雜的分析技術，受試劑純度、操作環境、儀器分析條件等各種條件的影響，需要專業的分析人員進行測定，無法滿足啤酒生產等大生產的實時定量和控制。應用賴氨酸生物傳感分析儀，直接測定麥芽汁中賴氨酸的含量，具有專一性強、檢測精度高、檢測速度快、穩定性好、操作簡單、使用成本低、酶膜使用壽命長等特點，且其測定結果與氨基酸分析儀、高效液相色譜比較，無顯著差異。

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