菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及保護作用機制＊

彭申明，陳 勤*，陳逸青，葉海燕，王 亭

(1.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230601;2.德國海德堡大學(xué)曼海姆醫(yī)學(xué)院，德國，曼海姆 68167)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，又稱老年性癡呆，其主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙［1］，并且其患病率隨年齡增加而升高［2］，在65歲以上人群中約為5%，85歲以上人群中約為20%。目前市場上治療AD西藥主要包括膽堿酯酶抑制劑、改善腦血液循環(huán)和腦細胞代謝藥物、鈣離子拮抗劑、自由基清除劑以及雌激素等［3］，但是這些西藥的臨床療效有限或者有一定的副作用［4］。菟絲子是旋花科植物菟絲子(Cuscuta chinensis Lam)的干燥成熟種子。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品，具有補腎益精，養(yǎng)肝明目，固胎止瀉之功效，是一味著名的補腎中藥?，F(xiàn)代研究表明，菟絲子總黃酮(Total flavonoids from semen cuscutae，TFSC)是其主要生物活性成分，藥理研究發(fā)現(xiàn)菟絲子或菟絲子黃酮在改善生殖內(nèi)分泌功能、抗氧化、營養(yǎng)神經(jīng)、增強免疫力、保護心血管和抗突變等方面均有較好的藥理作用，其中在對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的方面作用顯著［5］，有關(guān)TFSC是否能改善絕經(jīng)后女性AD患者學(xué)習(xí)記憶的報道鮮少，本實驗采用雙側(cè)卵巢摘除法制備小鼠內(nèi)分泌衰退癡呆模型，觀察TFSC對內(nèi)分泌衰退癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、血液中雌激素的含量、海馬神經(jīng)細胞凋亡率以及相關(guān)凋亡蛋白表達的影響，并探計其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔健康昆明種雌性小鼠60只，體重25～30 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合格證書:皖醫(yī)動準(zhǔn)字號01號。

1.2 藥物與試劑盒

菟絲子總黃酮，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室制備，經(jīng)HPLC測定其純度≥95%。戊酸雌二醇片，法國 DELPHARM Lille S.A.S，批號 221A，使用前研磨成粉，蒸餾水配成0.3 mg·kg-1濃度的混懸液;E2放射免疫分析測定盒，北京北方生物技術(shù)研究所，批號20120926;

1.3 儀器

GC-911γ放射免疫計數(shù)器，中科大科技實業(yè)總公司中加光電儀器公司產(chǎn)品;KDC-1044低速臺離心機，中佳科大創(chuàng)新股份有限公司;TGL-16G臺式高速離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠;HH-W恒溫水浴箱，金壇市恒豐儀器廠;RT-3100全自動洗板機，深圳雷杜公司;Sartorius XP56DR電子天平，德國梅特勒-托利多儀器有限公司;SMG-2型Morris水迷宮自動控制儀裝置(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司;DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀及DYCZ-40D型迷你轉(zhuǎn)移槽，北京市六一儀器廠;Fluor Chen E型凝膠成像儀，美國Protein Simple公司。

1.4 內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠模型的建立［6］

本室改良法:選取50只小鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液(350 mg·kg-1)深度麻醉，俯臥式固定于手術(shù)板上，剔除背部毛發(fā)，醫(yī)用酒精和碘酒消毒背部皮膚，以最后一根肋骨與脊椎中央交叉處為手術(shù)切口處，切開此處背部皮膚，再將皮膚輕輕向左側(cè)平移，暴露出即將手術(shù)區(qū)域，小心分離皮下腹膜，在脊椎向左約1 cm處用手術(shù)剪剪出約0.5～0.8 cm切口，可見乳白色脂肪，用鈍頭鑷輕輕牽出脂肪，可見其下方有一紅色菜花狀卵巢。在卵巢下方用消毒絲線結(jié)扎輸卵管并切除卵巢，縫合切口并消毒;右側(cè)摘除卵巢時，將皮膚輕輕向右側(cè)平移(免除兩次開刀)，其他方法同上。術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射青霉素粉針(4萬U·d-1)，防止感染。術(shù)后第3 d進行分組。將小鼠隨機分成5組，即去勢模型組，雌激素組(0.3 mg·kg-1)，菟絲子低、中、高(35，70，140 mg·kg-1)劑量組，每組10只。假手術(shù)組10只小鼠，同上法，但僅切開皮膚與腹膜，暴露卵巢，隨即進行消毒和縫合。造模3 d后開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃3個月，其中正常組和模型組均給予等體積的0.9%生理鹽水。

1.5 石蠟制片與HE染色

造模結(jié)束后，用10%水合氯醛將小鼠深度麻醉后固定在操作臺上，打開顱腔，取出大腦。將小鼠大腦一分為二成兩個半腦，一部分用于流式細胞儀和免疫蛋白印跡，另一部分放置于10%的中性福爾馬林固定，用來做石蠟制片。石蠟制片:取材→固定→流水沖洗過夜→70%乙醇2.0 h→80%乙醇1.5 h→90%乙醇1.0 h→95%乙醇1.0 h→100%乙醇 1.0 h→無水乙醇:二甲苯 =1∶1，30 min→二甲苯(I)20 min→二甲苯(II)20 min→浸蠟(I)1.5 h→浸蠟(II)1.5 h→包埋→4 μm厚度冠狀切片。HE染色:二甲苯(I)12 min→二甲苯(II)12 min→100%乙醇(I)3 min→100%乙醇(II)3 min→95%乙醇(I)3 min→95%乙醇(II)3 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→自來水洗10 min→蘇木素10-15 min→自來水洗10-20 min→1%伊紅3-5 min→95%乙醇分化30 s→95%乙醇(I)1 min→95%乙醇(II)1 min→100%乙醇(I)1 min→100%乙醇(II)1 min→二甲苯(I)1 min→二甲苯(II)1 min→中性樹膠封片→鏡檢。

1.6 Morris水迷宮行為學(xué)測試

Morris水迷宮分為控制系統(tǒng)(電腦軟件)和檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)為直徑120 cm水池，分為四個象限，將直徑為15 cm無色透明平臺置于第四象限中央位置，高度低于水面2 cm左右，池水溫度保持在25℃左右。6組小鼠于連續(xù)灌胃三個月后進行水迷宮實驗，包括(1)定位航行測試:連續(xù)訓(xùn)練6 d，每天兩次，依次從四個象限將小鼠頭朝池壁入水，記錄每只小鼠的逃逸潛伏期及游泳路程，若60 s后仍找不到平臺，以60 s計算;(2)空間探索測試:訓(xùn)練的第7 d開始進行空間探索實驗，撤去平臺，以第二象限為入水點，觀察各組小鼠在60 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)。

1.7 小鼠血液中E2的測定

試驗當(dāng)日15時左右采用眼眶取血法，取血約1 mL，室溫自然凝固或4℃冰箱放置30～60 min，3000 r.min-1離心 10 min，取血清置于 0.5 mL EP 管中，－80℃冰箱凍存。檢測時，從－80℃冰箱取出標(biāo)本，室溫下靜置1～2 h，待標(biāo)本完全溶解后，用E2放射免疫分析測定盒檢測E2。

1.8 流式細胞儀檢測海馬神經(jīng)細胞凋亡率

Morris水迷宮測試結(jié)束后，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉，斷頭后于冰上開顱取腦，置于冷PBS液中清洗去除殘余的血并縱向切開成兩個半腦，取其中一半腦迅速剝離出海馬，用眼科剪剪成小碎塊，加入3 mL PBS液，同時用吸管慢慢吹打，經(jīng)過200目篩網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，2000 r·min-1離心5 min，取上清，再次 800 r·min-1離心 10 min，棄上清，加入PBS液2 mL搖勻。將上述制備好的單細胞懸浮液調(diào)整濃度為1×106mL-1。取1 mL細胞懸液置于300 μL Binding Buffer液中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL Propidium Iodide，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng) 10～15 min，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況。

1.9 免疫印跡法檢測海馬細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

水迷宮測試后，如1.7項下操作，迅速剖取各組小鼠海馬組織。稱取海馬組織0.2 g，并用眼科剪于EP管中剪碎，加入0.5 mL WIP組織裂解液(WIP∶PMSF=100∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配)，低溫研磨裂解 30 min，4 ℃ 12000 r·min-1離心 15 min，吸取上清液，應(yīng)用BCA法進行蛋白含量測定。以PBS調(diào)各組蛋白濃度到一致，加入等體積的2×上樣緩沖液混勻，沸水中煮沸5 min變性，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，其中每個泳道蛋白上樣量為20～50 μg，電泳后將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜上;再將NC膜放入5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉4 h，TBST緩沖液漂洗片刻，將NC膜浸入TBST緩沖液稀釋的一抗溶液［Bax(1∶400)、Bcl-2(1∶300)、Cyt-c(1∶300)、Caspase-3(1∶300)及 β-actin(1∶1000)］，4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗3×10 min，轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG溶液(1∶2000)中，室溫孵育1.5 h，TBST緩沖液漂洗3×10 min，TBS漂洗10 min，采用化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠成像分析儀掃描結(jié)果，測定各條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白相對表達量為目的條帶與內(nèi)參的灰度比值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型小鼠大腦神經(jīng)細胞病理形態(tài)的影響

HE染色顯示:假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)細胞排列緊密整齊，神經(jīng)元呈圓形或者錐形，核漿比值較大，細胞核為圓形，錐體細胞形態(tài)特征明顯，軸突長而有規(guī)則，細胞膜清晰;模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列雜亂間有明顯裂縫，神經(jīng)元胞體縮小，胞漿空泡變大，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少;雌激素組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊而緊湊，軸突長而有規(guī)律，胞漿空泡較模型組明顯變少，神經(jīng)元數(shù)量增加。經(jīng)連續(xù)用藥3個月，與模型組相比，TFSC三個劑量組小鼠腦CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，主要表現(xiàn)為錐體細胞排列有序，且海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多，空泡也大為減少，其中以中、高劑量組效果更佳。見圖1。

2.2 菟絲子總黃酮對去勢小鼠血液中雌激素含量水平的變化

從表1可知，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠血液中雌激素含量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)灌胃給藥3個月后，與模型組相比，雌激素組小鼠雌激素水平上升差異極顯著(P＜0.01)，TFSC各劑量組血液中雌激素水平明顯增加，且TFSC的劑量呈一定的量效關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)。

表1 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠血清雌激素水平的影響(，n=10)Tab.1 Effects of TFSC on the levels of serum estrogen in Alzheimer’s disease mice’s serum with hypoendocrinism(，n=10)

表1 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠血清雌激素水平的影響(，n=10)Tab.1 Effects of TFSC on the levels of serum estrogen in Alzheimer’s disease mice’s serum with hypoendocrinism(，n=10)

與假手術(shù)組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比#P＜0.05，##P ＜0.01Compared with sham operation group，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜0.01;Compared with model group，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別Group劑量(mg.kg-1)Dose E2(pmol·L-1)Estradiol假手術(shù)組Sham operation group － 48.07 ±7.16##模型組Model group － 10.33±2.53 ＊＊雌激素組Estrogen group 0.3 37.57 ±5.15##TFSC低劑量組TFSC Low-dose group 35.0 14.93 ±4.85#TFSC中劑量組TFSC Middle-dose group 70.0 18.64 ±4.66##TFSC高劑量組TFSC High-dose group 140.0 27.53 ±5.78##

圖1 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)的影響(HE染色×400)(，n=10)Fig.1 Effects of TFSC on neuronal pathological morphology in hippocampus of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism(HE stain×400)(，n=10)

2.3 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠行為學(xué)變化的影響

表2和圖2的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠逃逸潛伏期和游泳路程顯著增加，穿越平臺次數(shù)明顯減少，差異極顯著(P＜0.01);連續(xù)灌胃給藥3個月后，與模型組相比，雌激素組小鼠逃逸潛伏期和游泳路程明顯減少，穿越平臺次數(shù)顯著增加(P＜0.01)，TFSC各劑量組小鼠逃逸潛伏期和游泳路程大大降低，穿越平臺次數(shù)增加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)，提示雌激素組和TFSC各劑量組均可提高內(nèi)分泌衰退癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.4 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率的影響

由流式細胞儀散點圖3可知，假手術(shù)組海馬神經(jīng)細胞的凋亡率為11.73%，模型組海馬神經(jīng)細胞凋亡率為75.68%，雌激素組海馬神經(jīng)細胞的凋亡率為29.73% ，TFSC 各劑量組(35 mg.kg-1，70 mg.kg-1，140 mg.kg-1)的海馬神經(jīng)細胞凋亡率分別為67.94% ，58.39% ，40.16% 。與假手術(shù)組相比較，模型組海馬神經(jīng)細胞凋亡率上升84.50%;與模型組相比，雌激素組和TFSC各劑量組海馬神經(jīng)細胞凋亡率顯著下降，分別為 60.72%，10.23%，22.85% 和46.93%。這表明雌激素和TFSC可明顯降低內(nèi)分泌衰退引起的海馬神經(jīng)細胞凋亡率。

2.5 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型小鼠海馬神經(jīng)細胞 Bax、Bcl-2、Cyt-c及 Caspase3蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組海馬區(qū)神經(jīng)元中Bax，Cyt-c和Caspase-3蛋白表達量均明顯升高，Bcl-2蛋白表達量降低顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);連續(xù)灌胃給藥3個月后，雌激素組和TFSC3個劑量組均能下調(diào)海馬區(qū)Bax，Cyt-c和Caspase-3蛋白表達水平，上調(diào)了Bcl-2蛋白的表達水平，與模型組相比，差異極顯著(P ＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.01)。見圖4。

3 討論

雌激素是女性卵巢分泌的主要激素，在女性乳房、子宮、陰道以及大腦等部位有其作用的靶點與特

異性受體。就學(xué)習(xí)記憶而言，雌激素與大腦海馬區(qū)神經(jīng)元核內(nèi)雌激素受體結(jié)合后通過基因表達生成一些有益神經(jīng)元生長、發(fā)育與存活的特異性蛋白，以保護海馬區(qū)神經(jīng)元細胞［7］。女性絕經(jīng)后，由于卵巢萎縮退化和功能減退，反饋性引起下丘腦-垂體-性腺等內(nèi)分泌器官功能的平衡失調(diào)，從而造成體內(nèi)雌激素水平逐漸降低，并引發(fā)女性認知功能下降等［8］，可見絕經(jīng)后雌激素水平隨增齡性下降是女性AD患病率增高的重要原因之一［9-11］。目前采用雌激素替代療法可以明顯改善和預(yù)防絕經(jīng)婦女癡呆的發(fā)生與發(fā)展，但是長期服用雌激素可增加AD患者的腫瘤發(fā)生［12］。文獻報道［13］菟絲子總黃酮能夠調(diào)控下丘腦-垂 體-性 腺 軸 (Hypothalamic pituitary gonadal axis，HPG)的功能紊亂，有效地增加腺垂體對促黃體素釋放素(Lutein releasing hormone，LRH)的反應(yīng)性，降低促黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)水平，刺激絕經(jīng)后女性體內(nèi)分泌雄烯二酮，再經(jīng)顆粒細胞在卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)中芳香化酶刺激下轉(zhuǎn)化為雌二醇，進而使體內(nèi)雌二醇水平顯著上升。本實驗發(fā)現(xiàn)，連續(xù)口服TFSC三個月后，TFSC各劑量組小鼠體內(nèi)雌激素水平顯著升高，推測TFSC可能有效促進或調(diào)節(jié)其下丘腦-垂體-性腺軸的功能，使機體的內(nèi)分泌功能減退得到一定程度的改善。

表2 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠Morris實驗逃逸潛伏期、游泳路程及穿越平臺次數(shù)的影響(，n=10)Tab.2 Effects of TFSC on escape latency、swimming distance and the times of across platform of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism in morris water maze test(，n=10)

表2 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠Morris實驗逃逸潛伏期、游泳路程及穿越平臺次數(shù)的影響(，n=10)Tab.2 Effects of TFSC on escape latency、swimming distance and the times of across platform of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism in morris water maze test(，n=10)

與假手術(shù)組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比#P ＜0.05，##P ＜0.01Compared with sham operation group，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;Compared with model group，#P ＜0.05，##P ＜0.01

圖2 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(，n=10)Fig.2 Effects of TFSC on learning-memory ability in Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism(，n=10)

圖3 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率的影響(，n=5)Fig.3 Effects of TFSC on neuronal apoptosis in hippocampus of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism(，n=5)

圖4 菟絲子總黃酮對內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元Bax、Bcl-2、Cyt-c和Caspase-3蛋白表達的影響(±s，n=5)。與假手術(shù)組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比#P ＜0.05，##P ＜0.01Fig.4 Effects of TFSC on the expression of Bax、Bcl-2、Cyt-c and Caspase-3 protein from Alzheimer’s disease mice’s hippocampus with hypoendocrinism(，n=5).Compared with sham operation group，

AD患者在臨床上以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要表現(xiàn)，Calissano P等研究發(fā)現(xiàn)［14］，AD患者的學(xué)習(xí)記憶功能障礙與其海馬區(qū)神經(jīng)元細胞大量丟失息息相關(guān)。女性絕經(jīng)前，體內(nèi)雌激素水平較高，雌激素可以通過與HPG軸上與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)大腦區(qū)域的雌激素受體結(jié)合，提升細胞內(nèi)神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)的表達水平，進而誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形成新的突觸，提高突觸的適應(yīng)性和神經(jīng)元的生長［15］。絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平大幅度下降，失去了雌激素對神經(jīng)元的營養(yǎng)和保護作用，誘發(fā)海馬區(qū)神經(jīng)元細胞經(jīng)線粒體途徑致細胞凋亡［16，17］。本實驗通過流式細胞儀和蛋白免疫印跡法檢測，證明雌激素組和TFSC各劑量組能顯著升高癡呆小鼠的E2水平，抑制海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率，可使抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達顯著提升，同時也明顯抑制癡呆小鼠促凋亡蛋白 Bax、caspase3的表達，減少Cyt-c的表達，顯示雌激素和TFSC具有良好的抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。Morris水迷宮結(jié)果顯示，E2和TFSC具有顯著改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)合TFSC具有提升雌激素水平和抑制細胞凋亡的作用來分析，我們認為雌激素和內(nèi)分泌功能的正常與否，直接影響到神經(jīng)元的可塑性、營養(yǎng)環(huán)境和存活率，間接地影響AD小鼠的學(xué)習(xí)記能力，這與臨床上絕經(jīng)后婦女易患老年性癡呆的現(xiàn)象有相似之處。我們推測，TFSC的作用機制可能與促進或增強下丘腦-腦垂體-性腺軸功能，增加雌激素水平和改善內(nèi)分泌系統(tǒng)功能有關(guān)。有關(guān)具有的作用機制，尚需進一步通過分子細胞水平上的驗證與探討。

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