熒光原位雜交探針應用于平衡易位t(1，6)(q42;p23)胚胎植入前診斷的研究＊

李江超，張仁禮，張麗麗，陳金娜，石慶榮，熊 麗，關新元，王麗京*

(1.廣東藥學院血管生物研究所，廣東 廣州 510006;2.廣東省人民醫院生殖中心，廣東 廣州 510030;3.香港大學臨床腫瘤研究部;4.廣東湛江久和醫院細胞遺傳室，廣東 廣州 524094;5.南方醫科大學南方醫院婦產科，廣東 廣州 510515)

染色體相互易位是最常見的染色體結構異常，其發生率為2%－5%。這類染色體異常通常無遺傳物質丟失，攜帶者通常無異常臨床表型，但其生殖細胞在減數分裂過程中由于分離方式異常，形成不平衡配子，導致反復自然流產、胎兒發育畸形、死產等妊娠結局［1］。

隨著植入前診斷技術的發展，對胚胎單細胞進行檢測，可選擇性的對優質胚胎進行移植，降低不良妊娠的發生率［2］。對于患者植入前診斷的方法的改進如新一代測序，比較基因組等以及特異性PCR方法獲得了一定的成功［3-5］。熒光原位雜交(FISH)也是植入前診斷的手段之一，與測序、比較基因組微陣列(arrayCGH)相比，FISH針對具體染色體相互易位進行探針設計，不僅可以診斷染色體不平衡易位，還可以發現染色體平衡易位改變［6-9］。

6號染色體異常在臨床上較為常見，其中與1號染色體的平衡易位比較多［10］，我們針對個體化的t(1;6)(q42;p23)患者異常的區域進行DNA探針設計，對正常人單細胞卵裂球進行檢測，希望初步實現個體化的診斷。這種個性化的診斷模式和研究的深入，有望隨著醫療水平的發展可真正的服務于臨床。

1 對象和方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料 女42歲，核型正常，其丈夫核型為t(1，6)(q42;p23)易位，曾多次自然流產，后繼發不孕。正常孕婦，其染色體正常，對其常規進行促排卵，體外受精3天后，選擇優質胚胎進行移植，其余廢胎用于檢測所制備的染色體平衡易位探針驗證。上述體外研究實驗獲得廣東省人民醫院倫理委員會同意。

1.1.2 試劑及儀器 FITC-dUTP，Texas red-dUTP購自美國GE公司，dNTP購自美國promega公司，Nick標記緩沖體系購自Life公司，原位雜交儀，封片橡皮膠，Block DNA solution購廣州外顯子生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 卵裂球的獲得 由臨床醫生依據IVF操作進行實驗，用機械法從胚胎(8個細胞，約第三天)取出1個細胞放在0.01N鹽酸中，暴露細胞核，甲醇:乙酸依據(3∶1)混合用于固定細胞，在顯微鏡下放置于玻片上，72℃，烤片30 min，備用。

1.2.2 探針設計和制備 依據G顯帶的核型結果，判斷患者核型是平衡易位:t(1，6)(q42;p23)，設計探針見圖2A，將1q42區域標記為紅色(Texas red)(BAC號:RP11-57P24)，6p23標記為綠色(FITC)(BAC:RP11-580K19)。結果判斷:相互易位形成18種配子，正常配子的概率比較低(1/18)，假如是正常配子，那么會出現兩紅兩綠，共4個亮點，如果相互易位或其他配子，會出現一個融合信號。制備FISH探針，如圖所展示，假如出現相互易位，如果信號融合，則呈現為黃色。我們采用Nick方法標記DNA探針，標記結果用2%電泳檢測，假如標記片段的大小在200-600 bp范圍內，表明混合片段大小合適。需要指出的是探針的標記是整個斷裂遠端位置，用來判斷是否發生斷裂或融合，不能直接反映配子是否正常。

1.2.3 單細胞原位雜交 用鉆石筆在玻片上畫圈，將單細胞低滲處理后，用固定液(乙酸∶甲醛溶液=3∶1)固定 0.5 h，20 mg/mL 蛋白酶 K 用 PBS稀釋100倍后，滴在單細胞上，37℃處理5 min，再用4%多聚甲醛固定5 min，梯度酒精脫水，干燥后，滴加探針，儲備探針混合依據:探針1∶探針2∶Block DNA solution∶水 =8∶8∶2∶2，將儲備探針用 DNA 雜交液按照1∶9稀釋，滴加 8 μL，蓋上 20 cm*20 cm 蓋玻片，橡皮膠封片，在雜交儀上共變性5 min在80℃條件下，37℃濕盒過夜，第二天，72℃條件下用2×SSC/0.1%NP40洗滌3 min，2×SSC洗滌一次。奧林巴斯BX43熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 患者異常和配偶(作為對照)的正常染色體核型

患者，男性，常規外周血染色體G顯帶核型分析診斷為平衡易位:46，XY(1，6)(q42，p23)參考圖1A，其配偶是正常核型圖1B，核型:46，XX。針對該案例我們進行，探針制備和驗證，為植入前診斷奠定基礎。

2.2 FISH探針設計和制備

我們按照G顯帶的核型結果，設計探針見圖2A，如果正常人核型，那么會出現兩紅，兩綠共4個亮點。首先制備FISH探針，我們將1q42區域標記為紅色，6p23標記為綠色，如圖所展示，假如出現易位，如果信號融合，則呈現為黃色。我們采用Nick方法標記DNA探針，標記結果2%電泳檢測如圖3A是標記片段的大小(200-600 bp)，說明探針混合片段大小合適。

圖1 患者和正常人(配偶)染色體核型Fig.1 The karyotype of Patient and his wife’s karyotype(Normal)

2.3 FISH探針的在正常人和患者中的驗證

為了驗證上述制備的平衡易位DNA探針的質量和雜交效率，我們在正常人染色體核型和患者染色體核型中進行FISH檢測，結果如圖所示，所制備的探針，可以檢測正常人的染色體信號見圖3A，而在患者的染色體核型中出現融合信號見圖3B。

2.4 卵裂球單細胞FISH植入前診斷

圖2 探針設計圖示(A)和探針片段驗證(B)Fig.2 Probe design and verified by electrophoresis gel

為進一步檢測所制備的探針是否可以應用于單細胞FISH，由于植入前診斷的對象為卵裂球單細胞，所以應進行單細胞FISH，其單細胞來源于輔助生殖中的廢胎(正常人)，檢測其靈敏度和優化FISH條件的實驗條件，我們用分離單細胞作為檢測目標，其FISH結果的效果，作為探針可行性與否的依據，其結果提示我們制備的FISH探針可以應用于單細胞診斷，而且信號比較強(曝光時間:200秒)。我們采用的5個細胞中，1，2，3號為正常核型，可以檢測到正確信號，4，5號細胞檢測失敗，結果代表圖片如圖4，兩紅兩綠，檢測成功率60%(3/5)。下一步所以我們考慮，有望應用于患者的植入前診斷，假如受孕成功，將進一步觀察子代的染色體核型。

3 討論

在染色體異常在人群中占一定比例，平衡易位的患者雖然不影響患者的日常生活，但容易導致配偶的流產［11］。由于平衡易位的斷裂位點往往不一樣，每個患者存的斷裂點特異性大［12-18］，我們針對平衡易位患者染色體特殊易位位點，制備了個體化的特異性易位判斷FISH探針，并在正常人和患者的中期染色體核型進行驗證，使其探針特異性更加準確有效，進行單細胞診斷，從而實現了個體化植入前診斷。

圖3 探針在正常染色體核型和患者染色體和核型上的驗證Fig.3 Probe Verification with the normal karyotype and patient karyotype by FISH

圖4 正常卵裂球單細胞FISH驗證探針的可行性Fig.4 Normal blastomere was used to performed single cell FISH with labeled probe

在研究中，我們針對平衡易位的1q和6p區域，制備染色體探針，繪制可以檢測攜帶者的平衡易位染色體探針，進一步正常人核型和患者中得確認，探針分別標記兩個易位片段，一個片段位于1q，另一個位于6q。讀取各探針信號數目即可知胚胎染色體是否相互易位，在卵裂球單細胞上原位雜交已經引起重視，對植入前診斷有著重要意義［19-21］。每種探針各出現兩個信號時胚胎染色體組成平衡，染色體未發生易位。而信號融合代表平衡易位的染色體的出現，基于上述原理，我們設計，制備，驗證，并在單細胞水平上驗證其探針的有效性。不足之處，值得說明的是在相互易位的配子中，可能會出現18種配子，所以檢出率不高，而且依據我們設計的FISH探針，僅僅是能夠判斷是否發生斷裂或融合，間接配子是正常，但不能直接排除配子是正常的，所以增加了風險，另外如果細胞內基因的位置恰好彼此較近，將帶來錯誤的判斷，導致假陽性結果。但是，目前尚沒有其他好的技術來提高植入前診斷的手段，所以需要投入更多的研究。

本方法中使用商業化BAC和Nick的方法進行探針標記，可行性高，重復性好，但檢出率低，能在正常人和患者同時驗證，提高了探針的特異性。避免了個體性差異，兼顧了克隆特異性探針的繁瑣過程，商業化的探針雖然穩定，但不能兼顧個體性需要，我們從設計制備驗證在兩周內結束，為了相互易位攜帶者的植入前診斷提供有力的工具，特異性探針的設計需要對斷裂點的準確判斷，即通過G顯帶進行準確定位之后而設計。本研究設計的特異性探針克服了商業化探針指定位點的局限性，通過吉姆薩染色后的染色體核型，設計針對特殊病人的探針，可以應用于植入前診斷。盡管本實驗，僅僅從該平衡易位的到驗證，我們相信針對每個特異性染色體易位都可以制備對應的探針進行嘗試，從而提高進一步的植入前診斷，從而能將這一技術應用于更多攜帶者，將其不利于健康的基因通過該過程的篩選，剔除那些易位的染色體。有利于提高人口素質，減少疾病和攜帶者的發生。

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