子宮內膜異位癥患者病變組織中miRNA-21、PTEN蛋白的表達變化及意義

何宏月，朱穎軍，王 芳，林婉君

(1天津醫科大學研究生院，天津300070;2天津市中心婦產科醫院)

子宮內膜異位癥(Ems)是具有生長功能的子宮內膜組織在子宮腔之外的部位浸潤生長所導致的疾病，其影響著6% ～10%的育齡期婦女，多種因素可促使EMs的發生［1］。miRNA是一類高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，其參與轉錄后水平的基因調節，miRNA與靶 mRNA的3'端的非編碼片段(3'UTR)配對，阻止該基因的翻譯過程或者促使其降解，從而調節基因的表達［2］。PTEN在 PI3K/Akt/PKB/cyclinD、FAK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR/STAT3等通路中有重要抑制作用，能促凋亡、抗增殖，而其缺失或突變則導致腫瘤的發生。文獻［3］發現，Ems中PTEN的表達降低。本研究觀察了Ems組織中微小RNA-21(miRNA-21)、PTEN蛋白的表達變化，并探討兩者在Ems發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年12月～2013年12月天津市中心婦產科醫院診斷為Ems并接受腹腔鏡手術治療的Ems患者30例(觀察組)，年齡(42±3.4)歲。全部病例均經術后病理證實。患者月經規律，無其他外科、內分泌、免疫及代謝性疾病，術前6個月內未接受GnRH類似物、激素類藥物及抗生素治療，無圍絕經期癥狀。術前行刮宮術收集在位內膜，術中取材卵巢的異位子宮內膜。另選同期因宮頸原位癌行子宮切除術的患者30例作為對照組，年齡(41±4.3)歲。術后無菌條件下刮取子宮內膜。兩組留取標本均經醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。所取組織置于Enpendorf管中，放入液氮罐，保存用于提取蛋白和RNA。

1.2 試劑與儀器 兔抗人PTEN單克隆抗體;鼠抗人GAPDH單克隆抗體;HRP標記羊抗兔抗體、HRP標記羊抗小鼠IgG二抗;mirVana TM miRNA Isolation Kit;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit;Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit;DYY-7C型電泳儀;DU640紫外分光光度計;Biometra PCR擴增儀;ABI Prism?7500型RT-PCR儀;電泳槽、玻璃板、海綿及樣品梳;引物由Primer 5軟件設計，具體引物序列:miRNA-21:GGACTAGCTTATCAGACTG，CATCAGATGCGTTGCGTA;U6snRNA:ATTGGAACGATACAGAGAAGAT，GGAACGCTTCACGAATTT。

1.3 miRNA-21和PTEN蛋白的檢測 ①miRNA-21:采用 RT-PCR法。用 TRIzol法提取組織中總RNA，用分光光度計測定OD值及RNA濃度，將提取的1 μL RNA加到20 μL體系中進行逆轉錄反應合成cDNA，之后在RT PCR儀器中進行qPCR實驗:95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，62 ℃、40 ～60 s，循環40次，行3次平行實驗。采用相對定量的方法，以U6的表達為內對照，依據公式ΔCt=Ct目的基因－Ct內參基因，分別計算觀察組和對照組的ΔCt，目的基因的相對表達量為2－ΔΔCt，記錄3次實驗的相對表達量，取其平均值。②PTEN蛋白:采用Western blotting法。提取組織中蛋白，等質量上樣電泳，經過轉膜、封閉、一抗及二抗孵育，最后加入顯影液，進行圖像分析。用Quantity One軟件進行灰度分析，將目的條帶與GAPDH的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量，記錄3次實驗結果，取其平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，結果比較用t檢驗及單因素方差分析;Pearson直線相關性檢驗分析觀察組miRNA-21、PTEN蛋白的相關性。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miRNA-21、PTEN蛋白表達比較 結果見表1。

表1 兩組miRNA-21、PTEN蛋白表達比較(±s)

表1 兩組miRNA-21、PTEN蛋白表達比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與同組在位內膜比較，﹟ P＜0.01

組別 n miRNA-21 PTEN 蛋白觀察組30 0.068 9±0.010 7 1.946 1±0.101 9 30異位內膜 0.416 8±0.052 7△﹟ 1.151 4±0.046 5△﹟在位內膜 0.241 4±0.033 3* 1.497 8±0.037 2△對照組

2.2 觀察組miRNA-21、PTEN蛋白表達的關系Pearson直線相關性檢驗分析顯示，觀察組miRNA-21表達與PTEN蛋白表達呈負相關(r=－0.464，P＜0.01)。

3 討論

Ems是一種具有一定惡性行為的婦科良性疾病，異位子宮內膜細胞的遷移、黏附、浸潤性生長及血管生成是其發生的病理基礎。近年來，轉錄后調控基因表達已經成為增殖性病變分子研究的熱點，作為自然形成的轉錄后調節因子，miRNAs通過調節基因表達的穩定性，在多種生命活動中發揮著重要作用，包括細胞生成、分化、凋亡、炎癥及免疫反應等，可能成為發病機制的關鍵因素［4］。

miRNAs通過抑制其靶mRNAs的表達或促進靶mRNAs的降解調控基因表達，導致一系列疾病的發生。miRNA的異常表達與許多人類的腫瘤發生、發展有關，其中miRNA-21位于17q23.1，在人類腫瘤中起重要作用，在腫瘤中表達升高，并促進腫瘤細胞的生長及增殖能力，包括宮頸癌、子宮內膜癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮肌瘤、EMs相關的卵巢癌［5～11］。本研究顯示，觀察組在位內膜、異位內膜中miRNA-21表達均高于對照組，這與上述在其他疾病中研究結果一致。Meng等［12］在人肝癌細胞中的研究發現，miRNA-21可以通過調節PTEN表達起到促進癌細胞增殖、遷移、浸潤的作用，PTEN是miRNA-21的直接作用靶點，PTEN mRNA的3'UTR區存在miRNA-21的直接結合位點，miRNA-21通過與之結合，在轉錄后水平調節PTEN的表達，參與多種疾病的發生、發展［12～14］。研究表明，miRNAs通過調節其廣泛的靶基因改變子宮內膜的生理及生物學特性，miRNA在異位內膜和正常內膜間的表達有差異，這些差異表達的miRNA可能與Ems的發生、發展有關［15］。但其作用的精細過程并不清楚，因此獲取更多的miRNA信息對于研究是必須的。現在的研究集中于三個方向:①在全基因組水平建立miRNA表達譜與編碼基因表達譜及其蛋白之間的聯系，揭示Ems發生的分子機理;②明確 Ems中miRNA的差異表達的構成及其生物特性變化;③發展有效的技術來精密地調節miRNA的表達，最終建立起新的治療方法。

抑癌基因PTEN又名MMAC1或TEP1，1997年分別由 Li等［16］、Li等［17］和 Steck 等［18］3 個研究小組發現，PTEN基因定位于10號染色體q23.31區，全長200 kb，包含9個外顯子和8個內含子，開放閱讀框由1 209個核苷酸組成，并編碼由403個氨基酸組成的蛋白。在Ems基因小鼠模型中，從Ems進展為子宮內膜樣癌依賴于克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因激活和第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物腫瘤抑制基因的失活［19］。PTEN蛋白同時具有脂質和蛋白雙特異磷酸酶活性，是迄今為止發現的第一個具有脂質磷酸酶活性的抑癌基因［20］。PTEN蛋白的脂質磷酸酶活性可使細胞周期停滯在G1/S期，還可以通過影響PI3K活性而控制Akt磷酸化水平，并激活Akt下游信號蛋白成員，作用于細胞生理的多個方面，包括調節細胞的黏附、轉移及分化等，從而促進細胞增生、血管形成、抑制凋亡［21］。本研究顯示，觀察組 PTEN蛋白表達降低，提示PTEN蛋白可導致異位內膜異常的增殖、黏附、遷移等，與Ems的發生密切相關。本研究還發現，觀察組miRNA-21表達與PTEN基因表達呈負相關，我們推測在Ems組織中高表達的miRNA-21可能通過抑制PTEN表達，調控子宮內膜細胞的生物學行為，促進子宮內膜在子宮腔以外的增殖、黏附、轉移及血管形成等，參與Ems的分子發病機制，但其具體調控功能尚需進一步研究。

隨著對于miRNA作用機制的進一步深入研究，miRNA很可能會成為疾病診斷的新生物學標志物，或是作為藥物作用的靶點進行新藥研發，為Ems治療提供新的手段。

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