控制性低壓后處理對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制探討

艾春雨，江曉菁，馬 虹，王俊科

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽(yáng)110001)

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱手術(shù)、動(dòng)脈瘤手術(shù)中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。截癱是脊髓缺血再灌注損傷后難以預(yù)測(cè)和最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)正在發(fā)生心肌梗死的患者行冠狀血管成形、支架植入后血管再通即刻行3個(gè)循環(huán)的氣囊放氣充氣處理，可使心肌梗死范圍縮小、反映心肌再灌注的指標(biāo)分級(jí)增加，且無(wú)不良反應(yīng)，提示該球囊式缺血后處理具有心肌保護(hù)作用［2，3］。將再灌注早期灌注壓控制在較低水平(45～55 mmHg)，即控制性低壓后處理，沒有附加缺血，操作簡(jiǎn)便，更易于臨床應(yīng)用。我們于2012年1～12月進(jìn)行本研究，探討控制性低壓后處理對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 日本大耳白兔32只，雄性，體質(zhì)量2～2.5 kg，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組，每組8只，即假手術(shù)對(duì)照組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、控制性低壓后處理組(P組)、控制性低壓后處理+ERK1/2抑制劑PD98059組(PD組)。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型的制備 方法參照文獻(xiàn)［3］。模型制備前12 h禁食，自由飲水。耳緣靜脈注射20%烏拉坦1 mg/kg麻醉;常規(guī)監(jiān)測(cè)心率和血壓;耳緣中動(dòng)脈穿刺置管，監(jiān)測(cè)近端動(dòng)脈血壓;股動(dòng)脈穿刺置管監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)端動(dòng)脈血壓;應(yīng)用電熱毯保溫，維持直腸溫度(38.5±0.5)℃;耳緣靜脈穿刺置管，靜脈輸注復(fù)方乳酸鈉林格氏液4 mL/(kg·h);將4 F球囊充氣導(dǎo)管置于左腎動(dòng)脈下1cm水平，靜注肝素150 U/kg后5 min，阻斷腹主動(dòng)脈進(jìn)行缺血，遠(yuǎn)端動(dòng)脈壓＜20 mmHg為缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)，缺血25 min時(shí)進(jìn)行再灌注，動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)為再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)。缺血后處理方法參照前期研究［4］。

1.2.2 鞘內(nèi)注射方法 于L5～6間隙行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺，將已消毒的 PE-10導(dǎo)管從 L5～6插入7.0～8.0cm，至脊髓胸段以回抽到腦脊液作為穿刺成功的標(biāo)志。緩慢抽出等量腦脊液后注入實(shí)驗(yàn)藥物，注射后保持頭高腳低體位1 h。

1.2.3 各組處理方法 ① S組:將4 F球囊充氣導(dǎo)管置于左腎動(dòng)脈下1cm水平，不行阻斷。② I/R組:再灌注時(shí)排空球囊，其余方法同1.2.1。③ P組:再灌注開始10 min后，將球囊部分排空，使腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端血壓控制在45～55 mmHg，10 min后球囊完全開放，其余方法同1.2.1。④ PD組:于腹主動(dòng)脈開放前1 min鞘內(nèi)注射 PD98059(3 μg/20 μL)，其余方法同P組。于再灌注24 h時(shí)，腹腔注射20%烏拉坦1 mg/kg，處死動(dòng)物。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法。取L3～4節(jié)段脊髓組織，10%甲醛溶液中固定，脫水、切片后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書進(jìn)行操作。在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇6個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，取平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。細(xì)胞核呈棕黃色為凋亡細(xì)胞。

1.2.4.2 脊髓組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量測(cè)定 羥胺法測(cè)定脊髓組織SOD含量，硫代巴比妥酸法測(cè)定脊髓組織MDA含量。

1.2.4.3 脊髓組織 p-ERK1/2、Caspase-3檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法。取L4～5節(jié)段脊髓組織，10%甲醛固定，脫水，石蠟切片(5 μm)。免疫組化步驟參照HistostainTMPlus Kits S-P 9000免疫組化染色試劑盒說明書(武漢博士德生物工程有限公司)。p-ERK1/2多克隆抗體稀釋度為1∶500、Caspase-3抗體稀釋度為1∶100。細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下(×400)隨機(jī)選擇6個(gè)視野，采用AX70顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司，日本)進(jìn)行分析，以平均光密度值反映p-ERK1/2及Caspase-3的表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡指數(shù)，SOD、MDA含量，Caspase-3、p-ERK1/2表達(dá)結(jié)果見表1。

表1 各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡指數(shù)、SOD、MDA、Caspase-3、p-ERK1/2比較 (±s)

表1 各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡指數(shù)、SOD、MDA、Caspase-3、p-ERK1/2比較 (±s)

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 I/R 組比較，△P ＜0.05;與 P組比較，#P ＜0.05

組別 n 凋亡指數(shù)(%) SOD［U/(g·prot)］ MDA［U/(g·prot)］Caspase-3 p-ERK1/2 S 組 8 2.76±0.25 312.25±19.56 1.02±0.21 39.22±15.30 29.32±11.53 I/R 組 8 45.43±5.15* 73.42±15.36* 7.62±0.33* 152.01±20.21* 82.01±21.32*P 組 8 17.24±3.63＊△ 179.76±16.33＊△ 3.66±0.58＊△ 107.45±19.16＊△ 192.82±29.71＊△PD 組 8 65.43±3.39*# 85.73±20.13*# 5.32±0.67*# 202.31±22.35*# 90.01±20.65*#

3 討論

研究證實(shí)，自由基損傷及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷的重要機(jī)制［4］。而脊髓組織膜結(jié)構(gòu)含有豐富的脂質(zhì)，易導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元的繼發(fā)性損害。SOD活性可反映氧自由基清除能力的高低，而MDA是目前公認(rèn)的能較好反映機(jī)體內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化損傷程度的間接指標(biāo)。研究顯示，SOD、MDA測(cè)定可以反映缺血再灌損傷的嚴(yán)重程度［5］，缺血后控制性低壓處理也可以影響活性氧自由基的生成［6，7］。本研究中缺血再灌注組MDA含量明顯增多，SOD含量明顯減少，提示脊髓組織損傷較重;控制性低壓后處理組MDA含量下降、SOD含量上調(diào)，提示組織抗氧化能力增強(qiáng)，脊髓組織損傷減輕;而PD98059可以抑制控制性低壓后處理引起的抗組織氧化能力的增強(qiáng)。

ERK1/2是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如凋亡)的過程中具有至關(guān)重要的作用，是信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)的傳遞者。ERK1/2活化引起細(xì)胞的增殖與分化［8］。活化的ERK1/2(p-ERK1/2)從胞質(zhì)進(jìn)入胞核，影響細(xì)胞功能狀態(tài)。一些學(xué)者認(rèn)為，ERK1/2通路激活作用與適應(yīng)、上調(diào)抗氧化因子轉(zhuǎn)錄等保護(hù)作用有關(guān)［9，10］。ERK1/2信號(hào)途徑與腦缺血后神經(jīng)元存活有關(guān)［11］，其是否參與脊髓缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用尚待進(jìn)一步研究。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)［3］，控制性低壓后處理促進(jìn)ERK1/2蛋白的磷酸化，減少細(xì)胞凋亡。本研究中，缺血再灌注時(shí)脊髓組織p-ERK1/2表達(dá)上調(diào)，其原因可能與脊髓缺血再灌注期間微循環(huán)障礙，導(dǎo)致缺氧啟動(dòng)修復(fù)有關(guān);而缺血后控制性低壓處理使p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，從而減輕脊髓缺血再灌注損傷。

Caspase家族是哺乳動(dòng)物凋亡機(jī)制中的關(guān)鍵因素，其中Caspase-3被認(rèn)為是此級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最具關(guān)鍵效應(yīng)的凋亡蛋白酶，是缺血再灌注損傷的重要事件。正常情況下，胞質(zhì)中Caspase-3以無(wú)活性酶形式存在，被凋亡信號(hào)激活后成為活性酶，活性的Caspase-3進(jìn)一步切割不同底物，導(dǎo)致DNA裂解，最終使細(xì)胞走向死亡［12～16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與缺血再灌注損傷組比較，控制性低壓后處理組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，而ERK1/2抑制劑PD98059阻斷了這種作用，提示缺血后控制性低壓后處理可通過ERK1/2途徑調(diào)控Caspase-3凋亡基因的表達(dá)。

綜上所述，控制性低壓后處理對(duì)脊髓缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與活化ERK1/2、抑制Caspase-3有關(guān)。

［1］Feezor RJ，Mart in TD，Hess PJ，et al.Extent of aortic coverage and incidence of spinal cord ischemia after thoracic endovascul ar aneury sm repair［J］.Ann T horac Surg，2008，86(6):1809-1814.

［2］Tsang A，Hausenloy DJ，Mocanu MM，et al.Postconditioning:a form of"modified reperfusion"protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway［J］.Circulation Research，2004，95(3):230-232.

［3］Jiang X，Ai C，Shi E，et al.Neuroprotection against spinal cord ischemia-reperfusion injury induced by different ischemic postconditioning methods:roles of phosphatidylinositol 3-kinase-Akt and extracellular signal-regulated kinase［J］.Anesthesiology，2009，111(6):1197-1205.

［4］Ballard JL.Thoracoabdominal aotic aneurysm repair:historical review and description of a re-engineered technique［J］.Perspect Vasc Surg Endovasc Ther，2005，17(3):207-215.

［5］艾春雨，閻雪晶，江曉菁.改良脊髓缺血后處理對(duì)兔缺血/再灌注損傷脊髓的保護(hù)作用［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40(6):501-503.

［6］王麗萍，張銓，陳國(guó)忠.ROS和PI3K-Akt在缺血后處理或控制性低壓灌注減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的作用［J］.中華麻醉學(xué)，2010，30(6):728-732.

［7］賀欣，張玉東，李北方.辛伐他汀缺血后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(5):27-29.

［8］Yamagishi S，Matsumoto T，Numakawa T，et al.ERK1/2 are involved in low potassium-induced apoptotic signaling downstream of ASK1-p38 MAPK pathway in cultured cerebellar granule neurons［J］.Brain Res，2005，1038(2):223-230.

［9］Gonzale-Zulueta M，F(xiàn)eldman AB，Klesse LJ，et al.Requirement for nitric oxide activation of p21(ras)/extracellular regulated kinase in neuronal ischemic preconditioning［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(1):436-441.

［10］Dash PK，Mach SA，Moore AN.The role of extracellular signalregulated kinase in cognitive and motor deficits following experimental traumatic brain injury［J］.Neuroscience，2002，114(3):755-767.

［11］Kilie E，Kilic M，Soliz J，et al.Brain-derived erythropoietin protects from focal cerebral ischemia by dual activation of ERK1/2-1/-2 and AKT pathways［J］.FASEB，2005，19(14):2026-2028.

［12］Gateau-Roesch O，Argaud L，Ovize M.Mitochondrial permeability transition pore and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70(2):264-273.

［13］Zhang X，Steiner MS，Rinaldy A，et al.Apoptosis induction inprostate cancer cells by a novel gene product，phyde，involves caspase-3［J］.Oncogene，2001，20(42):5982-5990.

［14］張峰，梅其炳，張濤，等.缺氧預(yù)適應(yīng)抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21(2):351-355.

［15］Terada K，Kaziro Y，Satoh T.Analysis of Ras-dependent signals that prevent caspase-3 activation and apoptosis induced by cytokine deprivation in hematopoietic cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，267(1):449-455.

［16］Carini R，Grazia De Cesaris M，Splendore R，et al.Role of phosphatidylinositol 3-kinase in the development of hepatocyte preconditioning［J］.Gastroenterology，2004，127(3):914-923.