99Tcm標記DPZM類右旋糖苷衍生物的淋巴結攝取

李洪玉，梁積新，楊春慧，羅洪義，莊 玲，陳 陽，孫桂全，鄭德強

(1.中國原子能科學研究院 同位素研究所 北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.中國核工業北京401醫院，北京 102413)

早期診斷是控制癌癥的關鍵手段之一。盡早發現局部淋巴結轉移灶對腫瘤的臨床分期、治療方案均有極大的意義。前哨淋巴結(SLN)是接受原發腫瘤淋巴回流的第一個或第一組淋巴結，是最早可能發生腫瘤轉移的特異淋巴結。前哨淋巴結活檢(SLNB)是指獲取前哨淋巴結并進行病理學檢查的技術手段。采用影像學手段準確定位SLN，對于癌癥的診斷和治療具有重要意義[1-2]，而SLN的成功檢出率很大程度上取決于顯像劑的選擇。目前臨床上最常用的SLN顯像劑有99Tcm-硫化銻膠體、99Tcm-硫膠體、99Tcm-人血清白蛋白、99Tcm-右旋糖苷等，但顆粒大小不均，每次注入顆粒總數不易控制。對顯像及活檢時間要求嚴格，在注射點高濃集，且大多是非特異性顯像劑，放射性易從SLN向次級淋巴結(2LN)遷移并使次級淋巴結顯像[3-5]。

研究表明[5-7]，右旋糖苷分子骨架，可修飾不同的化學基團而表現出不同的分子性質，另外還具有水溶性較好、低毒性、低免疫原性、在血液中不易降解等優點。99Tcm標記的甘露糖基化的右旋糖苷可與淋巴結巨噬細胞表面的受體結合，且其分子大小較為確定，體內分布性能較好，在SLN顯像方面具有可觀的應用前景。LymphoseekTM(99Tcm-tilmanocept，99Tcm-DTPA-甘露糖基右旋糖苷)作為一種具有受體結合性質的右旋糖苷顯像劑被用于SLN檢測，目前已被美國FDA批準上市[8]。

本研究擬用99Tcm標記連接有吡唑二胺基團的甘露糖基化的右旋糖苷衍生物(Dextran-amine-pyrazole-mannose，DPZM)類化合物，該類化合物可通過兩個氨基及吡唑環上的氮原子以NNN鍵與羰基锝進行螯合，形成穩定的配合物99Tcm-(CO)3-DPZM[9]，并對99Tcm-(CO)3-DPZM的生物分布和顯像以及不同注射劑量對正常鼠淋巴結攝取及體內分布的影響進行研究。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

99Mo-99Tcm發生器：原子高科股份有限公司產品；FH463A自動定標器、FT-603型閃爍探頭：北京核儀器廠；CRC 15R放射性活度計：美國CAPINTEC公司；微量注射器：美國 Hamilton公司；高效液相系統：ProStar 210型，美國Varian公司；HPLC放射性檢測器：德國Raytest公司；Milli-Q高純水制備系統：MILLIPORE公司。

1.2 主要試劑

Isolink藥盒：由Mallinckrodt-Tyco公司生產并贈送；右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8：由葡萄牙里斯本技術大學化學系的Isabel Rego Dos Santos教授提供；其他實驗所用試劑均為國產分析純，實驗用水均為去離子純化水。

1.3 實驗動物

BALB/c小白鼠：30 只，隨機分組，每組5 只，雌雄兼用，18～22 g；Wistar大鼠：50 只，隨機分組，每組3～5只，雌雄兼用，180～220 g；清潔級，均由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。

2 實驗方法

2.1 [99Tcm(CO)3(H2O)3]+的制備

向Isolink藥盒中加入1 mL 新鮮的Na99TcmO4洗脫液(37～370 MBq)，于95 ℃反應25～30 min，間歇振蕩，反應結束后，冷卻到室溫，用PBS-HCl緩沖液(0.64 mol/L，pH為2.5)調節pH為7.5～8.5。

2.2 DPZM-4、DPZM-8的99Tcm標記[10]

右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8的化學結構示于圖1。本研究對兩種甘露糖化右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8進行了99Tcm標記。將1 mL [99Tcm(CO)3(H2O)3]+溶液(37～370 MBq)分別加入到含有400 μg DPZM-4或DPZM-8凍干品的注射劑瓶中，搖勻，于98 ℃反應30 min，即制得標記物99Tcm-(CO)3-DPZM-4或99Tcm-(CO)3-DPZM-8。

2.3 99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DPZM-8的放化純度

采用高效液相色譜(HPLC)和放射性快速薄層層析法(ITLC)分析測定標記物的放化純度。HPLC分析條件：C18色譜柱(Hypersil ODS2，φ4.6 mm×250 mm)，紫外檢測器波長選擇254 nm，流速為1 mL/ min。淋洗液組成：流動相A 為 0.1%三氟乙酸的水溶液(TFA/H2O)，流動相B為 0.1%三氟乙酸的甲醇溶液(TFA/MeOH)；淋洗梯度：0～4 min，100% A，0 B；4～6 min，100%～75% A，0～25% B；6～17 min，75%～0 A，25%～100% B；17～25 min，0 A，100% B；25～30 min，0～100% A，100%～0% B；30～35 min，100% A，0% B。

ITLC分析以ITLC-SG層析紙(Gelman Sciences公司產品)為支持體，采用上行色譜法。展開體系1以2-丁酮為展開劑，展開體系2 以V(HCl)∶V(甲醇)=1∶20為展開劑，展開體系3以V(吡啶)∶V(乙酸)∶V(水)=3∶5∶1 為展開劑。

2.4 99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8的穩定性

將標記溶液用生理鹽水稀釋50 倍，于室溫下靜置5 h，用HPLC和ITLC分析放化純度，考察其體外穩定性。將99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8由小鼠腳墊皮下注射，給藥后1 h取尿液離心，取上清液進行HPLC分析，考察其體內穩定性。

2.5 標記物在正常鼠體內的生物分布

取健康BALB/c小鼠，隨機分組，每組 5 只；Wistar大鼠，隨機分組，每組 5 只。標記物溶液用生理鹽水稀釋至放射性濃度為3～37 GBq/L，pH為6～7.5，由正常鼠的右后足腳墊皮下進行不同劑量的注射。注射后按摩腳掌30 s以利于藥物吸收，分別于處死前10 min在給藥同側的腳墊處皮下注入專利藍溶液，再按摩腳掌30 s。分別于給藥后1、4 h處死，取前哨淋巴結SLN(即腘窩淋巴結)、次級淋巴結2LN(即腰淋巴結)、注射點(即右后足)、肝、脾、血等，對肝、脾、血稱重，測量各器官或組織的放射性計數，計算放射性攝取率(SLN、2LN、注射點單位為%ID，肝、脾、血的單位為%ID·g-1)，并計算SLN提取率(popliteal extraction rate，PE%)，公式如下：

PE%=[(SLN攝取率-2LN攝取率)/SLN攝取率]×100%

2.6 正常大鼠體內的淋巴結顯像

取Wistar大鼠，每組3 只，分為 4 組，于每只右后足腳墊皮下注射不同劑量的標記物，分別在給藥后不同時間點進行顯像，顯像前10 min腹腔注射0.8 mL 10%水合氯醛溶液對大鼠進行麻醉。顯像數據在計算機系統128×128 矩陣中進行記錄與分析，放大倍數1，采集放射性計數50 K/只。

3 結果與討論

3.1 99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8的制備及穩定性

對于ITLC分析，在展開體系1中，99TcmO4-在前沿，其余組分在原點；在展開體系2 中，99Tcm-(CO)3-DPZM類標記物在原點，其余組分在前沿；而在展開體系3中，99TcmO4-、 [99Tcm(H2O)3(CO)3]+、99Tcm-(CO)3-DPZM類標記物均在前沿。

99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8及標記物稀釋50 倍后的HPLC 譜圖示于圖2(a、b、d、e)。由圖2可知，99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8的放化純度>90%。

a——99Tcm-(CO)3-DPZM-4；b——99Tcm-(CO)3-DPZM-4 (稀釋50 倍，靜置)；c——99Tcm-(CO)3-DPZM-4小鼠代謝的尿樣品；d——99Tcm-(CO)3-DPZM-8；e——99Tcm-(CO)3-DPZM-8 (稀釋50 倍，靜置)；f——99Tcm-(CO)3-DPZM-8小鼠代謝的尿樣品.圖2 各種樣品的放射性HPLC分析圖a——99Tcm-(CO)3-DPZM-4；b——99Tcm-(CO)3-DPZM-4 (50 times dilution，on standing)；c——the urine sample from 99Tcm-(CO)3-DPZM-4 metabolism in mice；d——99Tcm-(CO)3-DPZM-8；e——99Tcm-(CO)3-DPZM-8 (50 times dilution，on standing)；f—— the urine sample from 99Tcm-(CO)3-DPZM-8 metabolism in mice Fig.2 Radio-HPLC profiles of the samples

由圖2b、e可見，將99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8溶液用生理鹽水稀釋50 倍，于室溫下靜置5 h，標記物緩慢分解(放化純度下降約10%)，有雜質和聚合物(ITLC分析)生成。

給藥后1 h，尿液的HPLC主峰保留時間未變(圖2c、f)，表明標記物在小鼠體內未發生分解，具有良好的體內穩定性。

3.2 標記物在正常鼠體內的生物分布

將99Tcm-(CO)3-DPZM-4經右后足腳墊皮下以注射劑量2 μg/25 μL(注射化學量/注射體積)注入正常BALB/c小白鼠體內，研究99Tcm-(CO)3-DPZM-4在正常小鼠體內的生物分布，并與99Tcm-(CO)3-DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)(注射劑量2 μg/25 μL)在正常小鼠體內的生物分布結果[11]進行對比(見表1)。

將99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8經右后足腳墊皮下分別以注射劑量0.006 μg / 5 μL注入BALB/c小白鼠體內，得到相同注射劑量下，兩種標記物的SLN攝取及體內分布影響的實驗對比結果(見表2)。

將99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8分別以不同注射劑量0.06 μg / 50 μL、0.05 μg / 10 μL注入Wistar大鼠體內，分別得到兩種標記物在不同注射劑量時的SLN攝取及體內分布的影響(見表3)。

根據淋巴結分布結果計算前哨淋巴結提取率PE%，PE%體現了藥物在前哨淋巴結滯留的比率，該值越大，說明藥物向下一級淋巴結遷移的可能性越小。

表1 99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DCM在BALB/c小鼠體內的生物分布結果對比

注：SLN、2LN、注射點攝取率的單位為%ID；肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

99Tcm-(CO)3-DPZM-4與連接有半胱氨酸基團的甘露糖基化的右旋糖苷類衍生物99Tcm-(CO)3-DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)的生物分布數據[11]比較可以看出，99Tcm-(CO)3-DPZM-4的SLN攝取和PE%均比99Tcm-(CO)3-DCM高。主要由于兩種配合物結構上的差異，DCM類化合物含有半胱氨酸基團支鏈提供了锝的配位點。

DPZM類標記物顯示了較理想的生物分布特征，而99Tcm-(CO)3-DPZM-8又略優于99Tcm-(CO)3-DPZM-4(見表2、表3)。DPZM-4與DPZM-8的化合物結構中每摩爾右旋糖苷螯合的吡唑基-二胺單元的數量不同，DPZM-4含有4個吡唑二胺螯合單元，DPZM-8含有8個吡唑二胺螯合單元，螯合的甘露糖基等基團的數量也略有不同。有研究[9]表明，99Tcm標記的DPZM類化合物的穩定性隨每摩爾右旋糖苷所螯合的吡唑基-二胺單元的數量的增加而增加，因此，99Tcm-(CO)3-DPZM-8的穩定性要優于99Tcm-(CO)3-DPZM-4。

表2 99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DPZM-8在BALB/c小鼠體內的生物分布結果對比

注：SLN、2LN、注射點攝取率的單位為%ID；肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

表3 不同注射劑量對99Tcm-(CO)3-DPZM-4與99Tcm-(CO)3-DPZM-8生物分布的影響

注：SLN、2LN、注射點攝取率的單位為%ID；肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8在Wistar大鼠體內的實驗結果(表3)顯示，注射劑量會影響此類衍生物的體內行為，當注射劑量 (包括注射化學量和注射體積) 減少時，SLN的攝取率顯著提高，SLN提取率也相應提高。注射體積由50 μL減少到10 μL而注射化學量接近時(0.06 μg和0.05 μg)，SLN的攝取增加一倍，SLN的提取率也顯著提高，存在顯著差異(P<0.01)，但也并不是注射劑量越低越好，注射劑量0.006 μg / 5 μL時的SLN攝取比0.06 μg / 50 μL和0.05 μg / 10 μL均低，差異顯著(P<0.005)。

在某些注射劑量及時相，DPZM化合物SLN 的攝取率并不算太高，但值得注意的是，SLN提取率基本都在70%以上，注射劑量為0.06 μg / 50 μL 時，注射后1 h到4 h，2LN攝取率呈下降趨勢，SLN的提取率隨之增加。

以上結果表明，DPZM類標記物生物分布較理想，具有較高的SLN攝取率，在肝、脾、血等重要組織或器官中攝取較低，且血清除較快。

3.3 Wistar大鼠的淋巴結SPECT顯像

99Tcm-(CO)3-DPZM-4分別以劑量a：0.5 μg / 50 μL，2.4×106Bq和劑量b：1.3 μg / 50 μL，6.3×106Bq注射入Wistar大鼠的體內，進行SPECT顯像研究，顯像結果示于圖3。99Tcm-(CO)3-DPZM-8的注射劑量與99Tcm-(CO)3-DPZM-4相同，SPECT顯像結果示于圖4。

由圖3、圖4可以看出，顯像結果與生物分布結果基本一致，99Tcm-(CO)3-DPZM類化合物具有較高的SLN攝取，給藥后5 min，SLN即已顯影，在隨后的各個不同時相，SLN顯像均非常清晰；雖然在注射點仍有較強滯留，但并不影響對SLN的觀察；在肝脾等重要臟器中濃集少，全身放射性本底較低。減少注射劑量可以提高SLN的攝取，有利于得到清晰的顯像效果。

a—0.5 g / 50 L，2.4×106 Bq；b—1.3 g / 50 L，6.3×106 Bq圖3 99Tcm-(CO)3-DPZM-4在Wistar大鼠體內顯像結果a—0.5 g / 50 L，2.4×106 Bq；b—1.3 g / 50 L，6.3×106 BqFig.3 SPECT images of 99Tcm-(CO)3-DPZM-4 in Wistar rats

c—0.5 μg / 50 μl，2.4×106 Bq；d—1.3 μg / 50 μl，6.3×106 Bq圖4 99Tcm-(CO)3-DPZM-8在Wistar大鼠體內顯像結果c—0.5 μg / 50 μl，2.4×106 Bq；d—1.3 μg / 50 μl，6.3×106 BqFig.4 SPECT images of 99Tcm-(CO)3-DPZM-8 in Wistar rats

4 結論

用[99Tcm(CO)3(H2O)3]+標記DPZM類甘露糖基化的右旋糖苷衍生物DPZM-4與DPZM-8，放化純度均>90%。實驗結果表明，99Tcm標記的DPZM類右旋糖苷衍生物在正常鼠體內可獲得較高的SLN攝取率和SLN提取率，在肝脾等主要器官的攝取低，血清除較快；另外，其生物分布對注射劑量較為敏感，當注射劑量(包括注射化學量和注射體積)減少時，SLN的攝取率和SLN提取率都相應提高。顯像實驗結果也表明適當減少99Tcm標記的DPZM右旋糖苷衍生物的注射劑量可以提高SLN的顯像效果。綜上所述，99Tcm標記的DPZM右旋糖苷衍生物具有優良的前哨淋巴結攝取及體內分布性質，具有應用于前哨淋巴結顯像的潛在價值，值得進一步研究。

參考文獻：

[1] Mariani G, Moresco L, Viale G, et al. Radioguided sentinel lymph node biopsy in breast cancer suegery[J]. J Nucl Med, 2001, 42: 1 198-1 215.

[2] Easson AM, Rotstein LE, McCready DR. Lymph node assessment in melanoma[J]. J Surg Oncol, 2009, 99: 176-185.

[3] 李艷，李囡，翟士楨，等．特異性前哨淋巴結顯像劑99Tcm-rituximab藥盒的制備及生物評價[J]．同位素，2011，24(增刊):85-89．

Li Yan, Li Nan, ZhaiI Shizhen, et al. Preparation and Evaluation of a Freeze-dried Kit of99Tcm-rituximab for Sentinel Lymph Node Imaging[J]. Journal of Isotopes, 2011, 24(S1):85-89(in Chinese).

[4] 李洪玉，梁積新，羅洪義，等．99Tcm-硫化錸膠體用于前哨淋巴結檢測的生物實驗――注射劑量與明膠濃度的影響[J]．同位素，2011，24(2)：72-76．

Li Hongyu, Liang Jixin, Luo Hongyi, et al. Biodistribution of99TcmLabelled Colloidal Rhenium Sulphide for Sentinel Node Detection: the Effects of Dosage and Concentration of Gelatin[J]. Journal of Isotopes, 2011, 24(2):72-76(in Chinese).

[5] Kyoko T, Tomoya U, Emi K, et al.99Tcm-labeled mannosyl-neoglycoalbumin for sentinel lymph node identification[J]. Nucl Med Biol, 2004, 31(7): 893-900.

[6] Hoh CK, Wallace AM, Vera DR. Preclinical studies of [99Tcm]DTPA-mannosyl-dextran[J]. Nucl Med Biol, 2003, 30(5):457-464.

[7] Antonia Woehnl, Carl K Hoh, Jeanette Méndez, et al. Molecular Imaging of the Sentinel Lymph Node via Lymphoseek[J]. Current Clinical Oncology, 2009, 4:123-133.

[8] Wallace AM, Han LK, Povoski SP,et al. Comparative evaluation of [99Tcm]tilmanocept for sentinel lymph node mapping in breast cancer patients: results of two phase 3 trials[J]. Ann Surg Oncol, 2013, 20(8):2 590-2 599.

[9] Alves S, Paulo A, Correia J,et al. Pyrazolyl derivatives as bifunctionalchelators for labeling tumor- seeking peptides with the fac-[M(CO)3]+ Moiety(M ) =99Tcm, Re): synthesis, characterization, and biological behavior[J]. Bioconjugate Chem, 2005, 16: 438-449.

[10] PirmettisI, Arano Y, Tsotakos T, et al. New (99m)Tc(CO)(3) Mannosylated Dextran Bearing S-Derivatized Cysteine Chelator for Sentinel Lymph Node Detection[J]. Mol Pharm, 2012, 9(6):1 681-1 692.

[11] 李洪玉，梁積新，楊春慧，等．99Tcm標記右旋糖苷衍生物DCM-1的淋巴結攝取和顯像[J]．同位素，2013，26(1)：16-22．

Li Hongyu, Liang Jixin, Yang Chunhui, et al. Lymph Nodes Distribution and Imaging Study of99TcmLabeled Dextran Conjugate DCM-1[J]. Journal of Isotopes, 2013, 26(1):16-22(in Chinese).