基于QPCR快速檢測米飯中產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的研究

張志鴻 王力均 甘 蓓 劉成偉 許恒毅 魏 華,

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室1，南昌 330047)(南昌大學中德聯合研究院2，南昌 330047)(江西省產品質量監督檢測院3，南昌 330029)(江西省疾病預防控制中心4，南昌 330000)

魏華，男，1966年出生，研究員，食品生物技術

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種兼性需氧的革蘭氏陽性菌，產芽孢，廣泛分布于土壤、水、空氣以及動物腸道中，有些菌株能引起食源性疾病，主要污染米飯、面條、糕點、牛奶和肉類等食品[1-3]。這類菌株因能分泌嘔吐毒素(cereulide)和腸毒素(enterotoxin)而引起食物中毒，其中嘔吐毒素主要能引起嘔吐癥狀，而腸毒素則會導致腹瀉。蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒通常是因其耐熱的芽孢在加工熱處理后部分殘留，而經過再次加熱條件的誘導可促使殘留的芽孢萌發并大量繁殖。據報道，食用該類蠟樣芽孢桿菌數量超過105CFU/g可能導致食物中毒甚至死亡[4-5]。國外蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件頻發，2006年德國17個兒童(3～5歲)因誤食被蠟樣芽孢桿菌污染的米飯，引起嘔吐和腹瀉[6-7]；2008年日本一個1歲的幼兒因食用反復加熱的蠟樣芽孢桿菌污染炒米飯中毒死亡[8]。蠟樣芽孢桿菌已被挪威和荷蘭認定為食品中最容易檢出的病源微生物[9]。目前我國尚未對由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件進行系統的調查、分析和統計，然而我國該菌中毒事件亦較為嚴重。2010年6月大連某中學29名學生在食用某營養套餐公司配送的午餐后出現腹痛、腹瀉癥狀；2011年江蘇某鎮12個人在進食流動攤位的涼皮后出現嘔吐、腹瀉癥狀；2012年9月河南濟源市某高中的24名學生在食用了餐廳的炒米飯后有8人出現頭痛、嘔吐腹瀉癥狀。后經實驗室檢測，上述癥狀均為蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒[10-12]。周幗萍等[3]認為隨著我國快餐、學生套餐等行業的快速發展，很容易引起大規模蠟樣芽孢桿菌中毒事件的爆發。因此，隨著我國對食品質量安全要求的提高，建立一種快速、靈敏的方法檢測食品中蠟樣芽孢桿菌至關重要。

目前細菌的傳統檢測方法主要是分離培養和血清學分析，包括增菌、選擇性培養、生化分析以及毒理學實驗等，整個過程復雜繁瑣，且特異性弱、靈敏度差。QPCR技術是20世紀90年代發展起來的一種準確、快速的核酸定量分析技術[13]，因其具有特異性強、靈敏度高、重復性好和能定量檢測等優點而被迅速應用到食源致病菌的快速檢測。Kim等[14]利用QPCR技術檢測了水果汁中單核增生李斯特菌的污染，Wang等[15]采用EMA結合QPCR檢測了牛肉中的大腸桿菌O157:H7。本研究針對編碼蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素合成酶的基因cesB設計特異性引物[16]，利用QPCR快速準確的優點，建立了一種SYBR Green I染料嵌合的QPCR方法，用于米飯中產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌(JDZ102Y)和不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌(DA0018L、DA0019L、NC0076L、NC0078L、JA0060、JA0093、FX0088Y、PX0026L1、JX0119LY、SRX001、JDZ0043Y、JDZ0041Y、YS0024L)由江西省疾病預防控制中心提供；金黃色葡萄球菌(CMCC26001)、黏質沙雷氏菌(CMCC41002)、普通變形桿菌(CMCC49101)、大腸桿菌O157: H7(NCTC12900)和阪崎腸桿菌(CMCC45401)由中國藥品生物制品檢定所醫學菌種保藏中心提供；志賀氏菌(ATCC29903)由國家標準菌庫提供；藤黃微球菌(CMCC28001)、銅綠假單胞桿菌(CMCC10104)和腸炎沙門氏菌(ATCC13076)由美國典型培養物保藏中心提供。

1.1.2 試劑和儀器

LB培養基、PBS(0.01 mol/L)：實驗室配制；Taq DNA聚合酶、SYBR PrimerExTaq：日本TaKaRa公司；PCR引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，其他試劑為國產分析純。

ABI 7900HT實時熒光定量PCR儀：美國應用生物系統公司；GelDoc XR凝膠成像系統：美國伯樂；TC-96 PCR擴增儀：杭州博日科技有限公司；TG16-W離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的培養

挑取產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌單菌落接種到5 mL LB液體培養基，37 ℃、180 r/min培養12 h。取1 mL菌液于1.5 mL無菌離心管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清，PBS洗滌2次后，用等體積PBS重懸得到濃度大約為108CFU/mL的菌懸液。利用此菌懸液測定QPCR的標準曲線。

1.2.2 基因組DNA提取

取1 mL上述菌懸液以12 000 r/min離心5 min，PBS洗滌1次后，用等體積的PBS重懸菌體。沸水中煮沸10 min，使DNA從細菌中釋放出來，迅速冷卻至室溫，以12 000 r/min離心5 min，上清液轉移至無菌離心管，-20 ℃保存備用。

1.2.3 引物特異性的驗證

按照1.2.1方法培養供試菌株，按照1.2.2方法提取基因組DNA。根據編碼蠟樣芽孢桿菌的特異性基因cesB合成上下游引物：上游5'-ACCCATCTTGCGTCATT-3′，下游5′-CAGCCAAGTGAAGAATACC-3'，擴增片段長度為154 bp。PCR體系為10 μL：2×Taq Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板2 μL，補加去離子水至10 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，GoldView核酸染色。用GelDoc XR凝膠成像系統成像。

1.2.4 QPCR反應條件

引物見1.2.3中cesB的上下游引物。QPCR的體系為20 μL：2×SYBR PrimerExTaq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，模板2 μL，補加去離子水至20 μL。擴增反應條件：首先95 ℃，30 s；然后95 ℃，5 s、58 ℃，1 min，進行40個循環。

1.2.5 人工污染食品的檢測

從當地超市購買新鮮米飯，采用傳統平板計數的方法檢測米飯無蠟樣芽孢桿菌污染。稱取25 g米飯樣品于225 mL LB培養基中，接種已知濃度的產嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌，使得米飯培養基混合液樣品中菌的最終濃度分別為100、101、102和103CFU/g，37 ℃靜置培養以達到增菌目的，在0、2、4、6 h分別從增菌培養基中取1 mL上清液于無菌離心管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清，PBS洗滌2次，等體積無菌水重懸，按照1.2.2方法提取基因組DNA。

1.2.6 雜菌干擾試驗

按照1.2.5污染米飯樣品的方法，實驗組接種不同濃度的產嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌，同時接種106CFU/g的金黃色葡萄球菌和106CFU/g的腸炎沙門氏菌。對照組直接接種不同濃度的產嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌。

2 結果與分析

2.1 cesB引物的特異性分析

PCR檢測結果顯示，編號為JDZ102Y的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌模板能擴出154 bp的特異性條帶，不產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌、非蠟樣芽孢桿菌以及用雙蒸水作為PCR模板的陰性對照均不能擴出條帶(圖1)，表明該方法對產嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌檢測具有很好的特異性，與其他非產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌以及非蠟樣芽孢桿菌無交叉。

圖1 引物特異性驗證

2.2 產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌標準曲線的建立

將濃度約為108CFU/mL產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌進行連續10倍梯度稀釋，取濃度依次為6.8×108、6.8×107、6.8×106、6.8×105、6.8×104CFU/mL的菌液提取DNA，分別以此為模板進行QPCR檢測。建立擴增標準曲線，橫坐標為PCR體系中菌液模板濃度的對數，縱坐標為熒光信號達到閾值時的循環次數，如圖2所示。其中標準曲線的回歸方程為y=-3.156 2x+36.414，相關系數為0.996 6，表示在稀釋的范圍內有很好的線性關系。擴增效率為107.4%，計算公式為E=10-1/slope-1[7]。

圖2 產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的擴增標準曲線

2.3 QPCR重復性試驗

分別選取5個不同濃度的菌液重復檢測3次，通過QPCR儀自動獲取的Ct值比較其差異來驗證方法的穩定性，結果如表1所示。由表1中可以看出，試驗偏差比較小，表明該方法具有很好的穩定性，從而證實標準曲線的可靠性，也為后續對模擬污染米飯中蠟樣芽孢桿菌的檢測準確性提供保證。

表1 QPCR檢測產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的重復性

2.4產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌模擬污染米飯的檢測

為了模擬實際污染樣本，接種低濃度的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌菌液于米飯中，定時取1 mL上清液，提取基因組DNA，進行QPCR檢測。根據Ct值和圖2的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的擴增標準曲線計算菌液的濃度。每個處理設置3個重復，結果如表2所示：接種濃度為100CFU/g菌液0 h時，QPCR檢測不出產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌；分別增菌2、4、6 h后，QPCR檢測到產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌濃度分別為2.2×102、1.8×103、3.6×106CFU/g。當接種濃度超過101CFU/g時，QPCR未經過增菌培養檢測到9.8×101CFU/g的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌。表明該方法不經過增菌在實際樣本最低可檢測到9.8×101CFU/g產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌；經過前增菌，該方法在模擬的污染樣本中可以檢測到濃度為100CFU/g的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌。

表2 人工污染米飯中的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的檢測

注：a-表示未檢測到。

2.5食品中雜菌對產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌檢測的影響

為驗證米飯中常見雜菌是否影響該方法的檢測結果，接種濃度分別為1.7×102、1.7×103、1.7×104、1.7×105和1.7×106CFU/g的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌于米飯中，同時分別向米飯中接種金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌，提取基因組DNA并進行熒光定量PCR。每個處理設置3個重復，作Ct值與產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌濃度的線性圖，如圖3。模板中含有雜菌的標準曲線的回歸方程為y=-3.171x+42.022，相關系數為0.992 2，擴增效率為100.7%；對照組的標準曲線的回歸方程為y=-3.187x+41.785，相關系數為0.998 8，擴增效率為100.6%；試驗組和對照組標準曲線回歸方程的相關系數均大于0.99，擴增效率也都接近100%，表明該方法的設置組都實現了較為理想的擴增，且雜菌的存在不影響蠟樣芽孢桿菌的擴增。

圖3 不同條件下產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的擴增標準曲線

3 討論

3.1 引物的特異性

本研究以產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌能編碼嘔吐毒素合成酶結構基因的特異性序列設計引物，并對引物的特異性進行了驗證，結果顯示只有產嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌作模板才能擴出目的條帶。說明cesB引物構建的PCR體系，不僅能從雜菌中區分產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌，而且能從所測試蠟樣芽孢桿菌中區別出產嘔吐毒素菌。因此，所設計合成的cesB引物具有較強特異性，可用于構建QPCR方法，并對產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌進行檢測。

3.2 產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的檢測限

采用本研究構建的QPCR反應體系分別對純培養和實際樣品中的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌進行檢測，結果表明該反應體系能檢測出污染食品中經過短暫時間增菌培養(2～4 h)的100CFU/g的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌，能直接定量檢測出污染食品中濃度超過101CFU/g的產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌，且不需要增菌培養過程，從而縮短了檢測周期。Dzieciol等[17]建立了基于gyrB的QPCR體系，對蠟樣芽孢桿菌污染的牛奶進行檢測，檢測限為1.91×103CFU/mL；Yabutani等[18]建立的基于crs的QPCR體系，對產毒蠟樣芽孢桿菌污染的米飯進行檢測，檢測限是104CFU/g。本研究建立QPCR體系的靈敏度高于上述研究。

3.3食品中雜菌對產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌檢測的影響

本研究建立的QPCR體系在檢測產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌污染的米飯時，添加雜菌濃度達到106CFU/g所獲得標準曲線的相關系數與擴增效率和不添加雜菌的結果沒有明顯差異，說明米飯中蠟樣芽孢桿菌的檢測不受雜菌影響，Dzieciol等[17]也報道在牛奶中添加單核增生李斯特菌對蠟樣芽孢桿菌的檢測不造成影響。試驗組和對照組標準曲線回歸方程的相關系數都大于0.99，說明利用該標準曲線可以對樣品進行準確分析；擴增效率均在90%～110%的合理范圍內，擴增接近理想擴增。

4 結論

研究結果表明，以cesB作為靶基因設計的引物特異性強，建立的QPCR方法檢測食品中產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌具有快速、特異性強、靈敏度高以及穩定性好的優點。建立的方法在污染的米飯中檢測限能達到101CFU/g，且雜菌對蠟樣芽孢桿菌的檢測沒有影響。本研究構建的基于QPCR快速檢測米飯樣品中產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的方法為相關食品中致病菌污染監管、食物中毒診斷和食源致病菌所致疫病的爆發提供了可借鑒的技術手段。

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