超聲輔助提取魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成分析

高 娟 樓喬明 楊文鴿 張群飛 張進杰 董栓泉

(寧波大學海洋學院，寧波 315211)

魷魚是海洋頭足類動物中槍烏賊和柔魚的俗稱，具有生長周期短、繁殖力強和資源恢復迅速等特點，已成為世界主要的遠洋捕撈品種和水產(chǎn)加工品種。目前各國對于魷魚的加工主要以魷魚干、即食魷魚絲、魷魚圈和冷凍魚糜制品為主，而占魷魚質(zhì)量15%～20%的肝臟，一般作為下腳料直接廢棄或加工成低值飼料[1-2]。魷魚肝臟油脂含量高，富含EPA和DHA等功能性脂肪酸，且其脂肪酸組成與魚油相似，可作為提取魚油的原料[3-5]。因此，充分利用魷魚肝臟既可減少資源浪費和環(huán)境污染，又能創(chuàng)造經(jīng)濟價值和社會效益。

超聲波是一種高頻機械振蕩波，其空化效應可以強化萃取速率和效果，縮短提取時間，減少溶劑用量，提高油脂的提取率[6-7]。目前國內(nèi)外對于超聲輔助提取魷魚肝臟油脂的文獻報道較少，本試驗采用超聲輔助有機溶劑法對魷魚肝臟油脂的提取條件進行優(yōu)化，并對其脂肪酸組成進行分析，以期為魷魚肝臟的精深加工和高值化綜合利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮秘魯魷魚肝臟勻漿，冷凍干燥成粉。參照文獻[8]的方法測定其總脂質(zhì)量分數(shù)為46.92%。

37種脂肪酸甲酯混標：美國Sigma公司；石油醚、乙醚、正己烷、異丙醇等分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

7890A型氣相色譜儀：美國Agilent公司；M7-80EI型質(zhì)譜儀：北京普析通用儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；FD-1D-80冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；SB-5 200DTS雙頻超聲波清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；EX-124型精密電子分析天平：奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取溶劑的選擇

稱取一定量的魷魚肝臟粉，分別以石油醚、乙醚、正己烷、正己烷-異丙醇(1∶1)、正己烷-異丙醇(3∶2)為提取溶劑，且以液料比8 mL/g，超聲波功率180 W，超聲時間30 min，溫度60 ℃對魷魚肝臟中的油脂進行提取。

1.2.2 單因素試驗和正交優(yōu)化試驗

確定提取溶劑后，以液料比、提取時間、溫度為考察因子，以油脂提取率作為考核指標進行單因素試驗設計；并在單因素試驗基礎上，采用極差法對上述3個因子進行正交優(yōu)化試驗。

1.2.3 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg魷魚肝臟油脂，加入1 mL正己烷充分溶解，再加入0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液1 mL，旋渦混合1 min，靜置分層后，取上清液無水Na2SO4干燥，供GC/MS分析。

色譜條件：DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣(He)采用恒壓模式，壓力為0.4 MPa。進樣量1 μL，分流比30∶1，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃。升溫程序為100 ℃保持4 min，10 ℃/min升溫至200 ℃，保持6 min，4 ℃/min升至250 ℃，整個分析過程40 min。

質(zhì)譜條件：GC/MS接口溫度250 ℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，全掃描模式檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品平行測定3次，采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，單因子方差分析(ANOVE，Tukey檢驗)進行顯著性檢驗，并采用Duncan’s法進行單因子多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

分別選用低毒的石油醚、乙醚、正己烷、正己烷-異丙醇(1∶1)以及正己烷-異丙醇(3∶2)為提取溶劑，在液料比8 mL/g，超聲功率180 W，提取時間30 min，提取溫度60 ℃的條件下進行超聲輔助提取，5種溶劑的提取率見表1。

表1 不同溶劑的油脂提取率

注：同一個圖表中標記不同字母的兩項間具有顯著差異(P<0.05)，下同。

由表1可知，不同溶劑對魷魚肝臟油脂的提取率具有顯著差異(P<0.05)，其中正己烷的提取率最低，僅為(75.91±0.63)%；而正己烷-異丙醇(3∶2)溶劑的提取率最高，為(88.06±0.81)%，遠高于石油醚和乙醚。有機溶劑提取油脂主要根據(jù)“相似相溶”原理，其提取效果與有機溶劑、原料和油脂的性質(zhì)密切相關。魷魚肝臟富含中性脂和極性脂，且油脂成分復雜[9]，單一性溶劑(正己烷、石油醚和乙醚)對其油脂的提取效果相對較低。因此選用正己烷-異丙醇(3∶2)作為提取溶劑進行單因素和正交優(yōu)化試驗。

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對提取率的影響

以正己烷-異丙醇(3∶2)為提取溶劑，在超聲功率180 W，提取時間30 min，溫度60 ℃條件下，不同液料比對魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖1所示。

圖1 液料比對提取率的影響

由圖1可知，當液料比在4～10 mL/g范圍內(nèi)，隨著提取溶劑用量的增大，魷魚肝臟油脂提取率逐漸增加；這是因為提取溶劑用量的增加降低了溶劑中油脂的濃度，增加了物料與溶劑間的濃度差，從而提高了物料中的油脂向溶劑擴散的速度，增大了提取率。當液料比達到10 mL/g時，提取率達到最大值，為(89.76±0.74)%；繼續(xù)增加液料比對提取率沒有顯著影響，且較高的液料比易造成溶劑和能源的浪費，并增加后續(xù)工藝的難度，因此魷魚肝臟油脂提取的最佳液料比為10 mL/g。

2.2.2 提取時間對提取率的影響

以正己烷-異丙醇(3∶2)為提取溶劑，在液料比8 mL/g，超聲功率180 W，提取溫度60 ℃條件下，不同提取時間對魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著提取時間的延長，油脂提取率先增大；并在30 min時，提取率達到最大值，為(88.05±0.73)%；之后隨著提取時間的增加，油脂提取率略有下降，這是因為隨著提取時間的增加，油脂中的熱敏成分損失致使提取率降低[10]。因此魷魚肝臟油脂的提取時間不宜過長，30min為最佳提取時間。

圖2 提取時間對提取率的影響

2.2.3 提取溫度對提取率的影響

以正己烷-異丙醇(3∶2)為提取溶劑，在液料比8 mL/g，超聲波功率180 W，提取時間30 min條件下，不同提取溫度對魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖3所示。

由圖3可知，在較低提取溫度時(20～50 ℃)，隨著提取溫度的升高，油脂提取率逐漸增大，這是因為提取溫度的升高增加了溶劑分子和油脂分子的動能，促進擴散運動的進行，致使油脂提取率增加[11]。當提取溫度為50 ℃時，油脂提取率達到最大值(88.86±0.58)%；此后提取溫度的增加對油脂提取率無顯著影響，因此魷魚肝臟油脂的提取溫度50 ℃較為適宜。

圖3 提取溫度對提取率的影響

2.3超聲波輔助提取魷魚肝臟油脂工藝條件的正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗，以正己烷-異丙醇(3:2)為提取溶劑，在超聲波功率180 W條件下，選取液料比、提取時間、溫度為試驗因素，以提取率為試驗指標，采用正交試驗方法考察各因素對油脂提取率的影響，試驗設計及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設計及結(jié)果

由表2可以看出，在超聲波輔助提取魷魚肝臟油的過程中，各因素對油脂提取率的影響依次為：液料比>溫度>提取時間，即液料比的影響最大，溫度次之，提取時間的影響最小。表3方差分析表明，液料比對魷魚肝臟油脂提取率有極顯著影響(P<0.01)，溫度對提取率有顯著影響(P<0.05)，而提取時間對提取率的影響不顯著；優(yōu)化試驗條件為A3B2C3，即液料比10 mL/g，超聲提取30 min，溫度60 ℃。對優(yōu)化條件進行驗證試驗，提取率達到91.26%，高于文獻報道的鉀法(82.09%)[12]和酶解法(90.67%)[13]；表明超聲輔助有機溶劑法是一種快速、高效提取魷魚肝臟油脂的方法。

表3 正交試驗方差分析

注：F0.05(2,2)=19.000，F(xiàn)0.01(2,2)=99.000，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.4 魷魚肝臟油脂的脂肪酸組成分析

將優(yōu)化條件下提取的魷魚肝臟油脂經(jīng)甲酯化處理，采用氣相色譜/質(zhì)譜法對其脂肪酸組成進行分析，其總離子流色譜圖見圖4；通過標準品對照和數(shù)據(jù)庫檢索對其脂肪酸組成進行定性分析，并按峰面積歸一法進行定量，分析結(jié)果列于表4。

表4 魚油脂肪酸組成分析

圖4 魷魚肝臟油脂脂肪酸組成總離子流色譜圖

從魷魚肝臟油脂中共分析鑒定出19種脂肪酸，以C16∶0(21.98%)、C18∶0(7.03%)、C18∶1n-9(17.19%)、C20∶5n-3(8.53%，EPA)和C22∶6n-3(22.60%，DHA)為主；其中多不飽和脂肪酸為38.33%，高于飽和脂肪酸(35.50%)和單不飽和脂肪酸(26.17%)。在所鑒定出的10種多不飽和脂肪酸中，以EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸為主，且DHA含量遠高于EPA，二者總質(zhì)量分數(shù)高達31.12%，高于墨魚(30.19%)[14]、沙丁魚(25.80%)[15]和鱒魚(12.39%)[16]。EPA和DHA作為人和動物生長發(fā)育的必需脂肪酸，具有促進嬰幼兒大腦發(fā)育、調(diào)節(jié)血脂、預防動脈硬化和腦血栓等心血管疾病以及提高免疫力等多種生理功能[17]。魷魚肝臟油脂中含有豐富的EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸，表明其有較高的營養(yǎng)保健價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可作為EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要膳食來源。

3 結(jié)論

3.1 經(jīng)單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到超聲輔助提取魷魚肝臟油脂的最佳條件：正己烷-異丙醇(3∶2)為提取溶劑，液料比10 mL/g，提取時間30 min，溫度60 ℃；在該提取條件下，魷魚肝臟油脂提取率為91.26%。

3.2 魷魚肝臟油脂富含EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸，兩者總質(zhì)量分數(shù)高達31.12%，表明魷魚肝臟油脂具有較高的營養(yǎng)價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可作為EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要膳食來源。

[1]Chen X, Liu B, Chen Y. A review of the development of Chinese distant-water squid jigging fisheries [J]. Fisheries Research, 2008, 89(3): 211-221

[2]劉春娥, 林洪, 單俊偉, 等. 魷魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)酶解工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2004, 25(9): 83-85

[3]郭無瑕, 胡建恩, 王秀武, 等. 魷魚肝臟魚油的制備及其脂肪酸組成分析[J]. 大連水產(chǎn)學院學報, 2007, 22(1): 77-80

[4]肖玫, 歐志強. 深海魚油中兩種脂肪酸(EPA和DHA)的生理功效及機理的研究進展[J]. 食品科學, 2005, 26(8): 522-526

[5]Lee J E, Seo M H, Chang Y H,etal. Cholesterol removal from squid liver oil by crosslinked β-cyclodextrin [J]. Journal of the American Oil Chemists' Society, 2010, 87(2): 233-238

[7]單成俊, 周劍忠, 黃開紅, 等. 超聲波輔助提取黑莓籽油及其脂肪酸組成分析[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(5): 62-64

[8]樓喬明, 王玉明, 徐杰, 等. 櫛孔扇貝和海灣扇貝脂質(zhì)及其脂肪酸組成分析[J]. 中國食品學報, 2012, 12(11): 198-203

[9]Kenji H, John R B. Lipid composition of the digestive gland, mantle and stomach fluid of the Gonatid squidBerryteuthisanonychus[J]. Journal of Oleo Science, 2004, 53(1): 1-8

[10]朱紅葉, 馬永昆, 魏本喜. 超聲輔助提取黑莓籽油及其脂肪酸成分分析[J]. 中國油脂, 2010, 35(6): 5-8

[11]許暉, 孫蘭萍, 李善菊, 等. 超聲波輔助提取亞麻籽油的工藝條件優(yōu)化[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(7): 64-68

[12]張偉偉, 陸劍鋒, 焦道龍, 等. 鉀法提取斑點叉尾鮰內(nèi)臟油的工藝研究[J]. 食品科學, 2009, 30(24): 42-46

[13]吳祥庭. 響應面法優(yōu)化酶法水解提取鯊魚魚油條件[J]. 中國糧油學報, 2007, 22(1): 91-94

[14]Shen C, Xie J, Xu X. The components of cuttlefish (SepiellamaindronideRodhebruns) oil [J]. Food Chemistry, 2007, 102(1): 210-214

[15]Chakraborty K, Vijayagopal P, Chakaborty R D,etal. Preparation of eicosapentaenoic acid concentrates from sardine oil byBacilluscirculanslipase [J]. Food Chemistry, 2010, 120(2): 433-442

[16]Fiori L, Solana M, Tosi P, et al. Lipid profiles of oil from trout (Oncorhynchusmykiss) heads, spines and viscera: Trout by-products as a possible source of omega-3 lipids[J]. Food Chemistry, 2012, 134(20): 1088-1095

[17]郭玉華, 李鈺金. 水產(chǎn)品中EPA和DHA的研究進展[J]. 肉類研究, 2011, 25(1): 82-86