大米過氧化氫酶活性的2種測定方法比較

郎 杰 朱銀碩

(河北經貿大學生物科學與工程學院，石家莊 050061)

大米在儲藏過程中會由于自身陳化作用而劣變，降低大米品質，大米的儲藏保鮮問題一直倍受重視。檢測大米等谷物的陳化程度或新鮮度有很多指標[1]，酶活性檢測也是其中之一，例如在糧油檢驗中的過氧化氫酶(CAT)活動度檢驗。

大米儲藏中的代謝會產生少量過氧化氫使大米脂質等成分氧化而品質下降。大米中的過氧化氫酶可將產生的過氧化氫分解減輕氧化作用，大米中的過氧化氫酶活性與大米儲藏品質有密切關系[2]。

過氧化氫酶的測定方法有十幾種[3]，例如氣量法、滴定法、分光光度法、熒光法、電化學法等。糧油檢驗的國家標準一直使用高錳酸鉀滴定法[4-5]。滴定法優點是所用設備簡單，不需貴重儀器，缺點是測定中憑肉眼觀測滴定終點，不可避免地存在較大的人為判斷誤差，以及操作中滴定液流量的控制誤差。以鉬酸銨作為反應終止劑和顯色劑對過氧化氫酶進行分光光度法測定，已廣泛用于動物血清測定及臨床檢驗，但在糧谷類測定中尚未采用。本試驗應用鉬酸銨比色法與高錳酸鉀滴定法一同測定大米中過氧化氫酶活性，以探討鉬酸銨法用于糧谷檢驗的可行性。同時也選擇不同產地大米測定其過氧化氫酶活性是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇6種市售商品大米，分別產自黑龍江的佳木斯和哈爾濱地區、遼寧盤錦地區、河北唐山地區、安徽阜陽地區和廣東佛山地區(品種略去)，依次標號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。各稱取100 g測定水分，將其余大米放置冰箱預冷(-15 ℃)24 h，粉碎過100目篩(150 μm孔徑)后仍置冰箱備用。

1.2 主要試劑和儀器

過氧化氫(H2O2含量30%)、高錳酸鉀和鉬酸銨等試劑均為分析純。草酸鈉基準試劑購自阿拉丁試劑有限公司。

UV-752型可見紫外分光光度計：上海光譜分析儀器廠； Avanti J-25型高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 過氧化氫酶提取與測定

1.3.1 高錳酸鉀滴定法(國標法)

過氧化氫酶提取及活性測定參照文獻[5]進行，包括試劑配制和標定。

稱取5.00 g(已扣除水分)過篩后的大米粉，加入50.0 mL pH 7.8 PBS(磷酸鹽緩沖液)，研磨振蕩混合后置冰箱預冷1 h，在冷凍離心機中6 000 r/min離心15 min，收集上清液得到過氧化氫酶粗提液。提取的粗酶液立即按文獻描述方法進行測定并按文獻[5]公式進行計算。每樣本(大米)分為6組測定，分2批由2人分別進行，每組測定設3次重復。同時用標定的過氧化氫配制0.01%～2.00%的一系列標準液滴定做高錳酸鉀滴曲線,以檢驗不同濃度與滴定液體積的線性關系。

1.3.2 鉬酸銨比色法(鉬酸銨法)

過氧化氫酶提取與前項相同。測定方法參照文獻[6]略作改動。底物溶液為60 mmol/LH2O2(用高錳酸鉀標定)，PBS為60 mmol/L的Na2HPO4和NaH2PO4(pH 7.8)。

3組試管分別標記為空白管1、空白管2和測試管，均加入5 mL 60 mmol/L過氧化氫溶液，再向空白管1中加入5 mL 50 mmol/L鉬酸銨溶液和3 mL煮沸的提取酶液；空白管2中加入5 mL 50 mmol/L鉬酸銨溶液和3 mL PBS；測試管中加入3 mL 提取酶液，搖勻后在30 ℃下水浴15 min，然后立即加入5 mL 50 mmol/L鉬酸銨溶液搖勻。與前2管一起用分光光度計在410 nm處測定吸光度。以每分鐘分解1 μmol過氧化氫為1個酶活單位(U)，參照文獻[6]中公式計算酶活性。然后換算為酶活動度(mgH2O2/g)。

式中:分子項60為反應液H2O2濃度/μmol，5為反應液量/mL，50為提取酶液量/mL；分母項中3為待測酶液量/mL，5為大米樣品質量/g，15為反應時間/min。

每樣本(大米)分為6組測定，每組測定設3次重復。再由不同試驗者重復測定1次。同時用標定的過氧化氫配制0.01%～2.00%的一系列標準液再按空白管2方法做鉬酸銨吸光曲線,以檢驗不同濃度與吸光度的線性關系。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1標定過氫化氫的高錳酸鉀滴定曲線和鉬酸銨吸光曲線比較

用標定的不同質量分數的過氧化氫(0.01%、0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%)分別進行高錳酸鉀滴定和鉬酸銨比色做標準曲線(圖1),2條曲線幾乎完全平行，高錳酸鉀滴定體積與過氧化氫濃度的相關性為R2=0.999(r=0.999**，P<0.01)，鉬酸銨比色的吸光度與過氧化氫濃度的相關性為R2=0.998 6(r=0.999**，P<0.01)，都達到極顯著相關，表明二者在測定過氧化氫的線性關系和濃度適應范圍上幾乎是相同的。

圖1 標定過氧化氫的高錳酸鉀滴定曲線和鉬酸吸光曲線比較

表1 高錳酸鉀滴定法測定6個產地大米過氧化氫酶活動度(mgH2O2/g)分析

2.2高錳酸鉀滴定法對6個產地大米過氧化氫酶活動度的測定及分析

高錳酸鉀滴定法測定6個產地大米中過氧化氫酶活動度平均10.22 mgH2O2/g，活動度變化約在8.05～12.02 mgH2O2/g間，產地偏北方地區樣本相對略高于偏南方地區樣本。2批測定的均值差與均數之比未超過文獻[5]的國標誤差限度，符合測定要求。2批測定結果為顯著相關(表2)。但從方差分析表中可以看出，誤差一項明顯較高，使產地因素差異不夠顯著。

2.3鉬酸銨比色法對6個產地大米過氧化氫酶活動的測定及分析

鉬酸銨法測定結果表明，6個產地大米過氧化氫酶活動度平均為11.66，活動度變化在9.05～13.88 mgH2O2/g 之間，大米產地活動度趨勢與高錳酸鉀法測定一致，但各樣本測定值均略高于高錳酸鉀法。2批測定的均值差與均數之比小于高錳酸法測定法，同樣未超過文獻[5]的國標誤差限度，符合測定要求。2批測定結果為極顯著相關。從方差分析表中可以看出，誤差一項的變異遠小于產地因素變異，略大于測定組因素。與高錳酸鉀法相比，用鉬酸銨法測定產地因素差異較為顯著。

2.4 2種方法測定6個產地大米過氧化氫酶活性的比較分析

為比較2種測定方法的差異，將2種方法的測定結果列于表5。

表2 高錳酸鉀滴定法測定6個產地大米過氧化氫酶方差分析表

表3 鉬酸銨比色法測定6個產地大米過氧化氫酶活動度(mgH2O2/g)分析

表4 鉬酸銨法測定6個產地大米過氧化氫酶方差分析表

表5 2種方法測定6個產地大米過氧化氫酶活性比較

注：酶活動度均數為6次測定平均值；測定組內活動度差值為同一樣本在不同測定組中的最小值與最大值差；表5中均數差異顯著比較為LSD(P<0.05)，字母不重復者間為差異顯著；鉬酸銨法1和2表示2批重復性測定。

從過氧化氫酶活動度的測定結果看，鉬酸銨法測定的6個產地樣本平均數高于高錳酸鉀滴定法1.44個活動度。從測定的穩定性方面，鉬酸銨法明顯好于高錳酸鉀法，高錳酸鉀法測定組內平均差值為5.78，鉬酸銨法為3.44，雖然二者都存在波動，但鉬酸銨法的波動相對較小。由前面的方差分析表中也可以看到，高錳酸鉀法的誤差大于鉬酸銨法。由此，2種方法對多個樣本測定結果的差異顯著性比較時，鉬酸銨法更能反映不同樣本間的差異。如表5中的不同產地樣本過氧化氫酶活動度差異顯著性的成對比較中，高錳酸鉀法只出現5對差異顯著，鉬酸銨法則出現11對差異顯著。對于比較不同樣本的過氧化氫酶活動度，鉬酸銨法更為適合。鉬酸銨法對6個產地樣品的過氧化氫酶活動度的2批測定(表5中的B和C)與高錳酸鉀法測定(表5中的A)的相關性為極顯著。

3 討論

鉬酸銨法目前多用于測定動物血清中過氧化氫酶。用高錳酸鉀滴定法測定大米過氧化氫酶活動度只限于糧油檢驗報告中，在專業性學術刊物中鮮見報道。本試驗應用2種方法對大米過氧化氫酶進行測定比較，測定數據表明鉬酸銨法明顯優于目前國家標準中的高錳酸鉀滴定法。高錳酸鉀法測定數據波動相對較大，原因主要是操作中滴定液的流量憑手感控制以及終點顏色變化憑肉眼觀察，容易導致誤差產生。其次，高錳酸鉀滴定雖是等當量反應，但受反應液酸度影響很大也會引起誤差。與高錳酸鉀滴定法相比較，鉬酸銨法穩定性較好，操作相對較為簡單，可大批量測定，由此認為糧谷類過氧化氫酶檢驗采用鉬酸銨法取代國家標準中的高錳酸鉀滴定較為可行。但鉬酸銨比色法要作為標準方法用于糧谷檢測，許多操作細節及各項反應條件設置還有待于進一步優化或改進。

至于本試驗測定中鉬酸銨法測定值略高于高錳酸鉀滴定法，推測其原因可能在于酶提取液中的微量淀粉等物質在保溫反應中顆粒膨大增加少量光吸收，尤其是作為空白的煮沸酶液，這可嘗試通過減少酶提取液用量，以及對酶提取液嚴格過濾解決。或也可能還有其他原因，這有待于進一步研究。

本試驗也嘗試了用直接紫外分光光度法和重鉻酸鉀比色法測定大米的過氧化氫酶(數據未列出)，但其穩定性和適用性均不強于高錳酸鉀滴定法。還有一些利用過氧化氫與喹啉、魯米諾、聯苯胺等發色物質反應生成有色物質進行比色測定的方法，例如聯吡啶或喹啉等可與H2O2反應產生熒光，過氧化氫酶可分解H2O2減少熒光產生，由此檢測過氧化氫酶活性[7]；魯米諾可受過氧化氫酶催化H2O2分解時產生的氧自由基激發而發光，測定發光值的增加可反映CAT活性[8]。這類方法雖反應靈敏，但對測定條件及反應時間要求嚴格，控制不當則穩定性明顯降低，測定過程較難掌握。

過氧化氫酶活性在國標GB/T 5522—2008中用過氧化氫酶活動度表示有待商榷。從過氧化氫酶活動度的單位mgH2O2/g來看，是表示每克樣品中能催化過氧化氫分解的質量(mg)，實際仍是表達的酶活性大小的概念。國際生物化學聯合會(IUB,現名為國際生物化學與分子生物學聯盟 IUBMB)酶學委員會曾于1961年規定每分鐘催化1 μmol底物轉化為產物所需的酶量為1個國際單位(IU或U)，雖已廣泛使用但并未被國際計量委員會(CIPM)承認為SI單位。國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)與國際臨床化學聯合會(IFCC)推薦使用的酶活性單位katal(符號kat)于1999年被國際計量大會(CGPM)批準，也尚未獲得國際計量委員會承認，但其成為新的國際單位制(SI)基本已成事實。所以酶的活性單位傾向于使用kat(1 kat=1 mol/s)[9-10]。質量催化活性單位應為kat/kg或其分數單位[11]。kat和U的關系為：1U=16.67×10-9kat =16.67×10-6mkat =16.67×10-3μkat =16.67 nkat。

盡管酶的活動度、酶的活性單位U (IU)及kat都未納入我國的國際單位制標準GB 3100—1993中，但從3個單位的比較看，kat單位相對更規范一些。我國在某些出版行業已要求酶的活性單位使用kat[12]。因此建議過氧化氫酶檢驗標準中改用kat較好，更便于與其他研究結果進行比較。

4 結論

通過試驗中鉬酸銨法和高錳酸鉀滴定法對不同產地大米樣本過氧化氫酶活動度測定的比較和分析，認為鉬酸銨法在測定糧谷過氧化氫酶方面優于現行國家標準中的高錳酸鉀滴定法，其優點在于測定中體現出較好的穩定性，重復測定間波動性明顯低于高錳酸鉀法，因此在比較不同樣本過氧化氫酶活性差異具有相對較高的分辨力；由于鉬酸銨法比色測定較為簡單，可進行大批量樣本測定。另外由于鉬酸銨法所需試劑少，操作簡便，容易掌握，而高錳酸鉀法配制試劑時間長而麻煩，滴定操作也不便于大批量樣本測定，所以鉬酸銨法適用性更強。通過以上分析認為鉬酸銨法更適用于糧油檢驗中的過氧化氫酶檢測。

[1]祁明霞,林艷,解彬.大米新鮮度及其影響因素的研究[J].啤酒科技,2007(9):23-29

[2]宋偉,陳瑞,劉璐.不同儲藏條件下糙米中過氧化氫酶活動度的變化規律[J].糧食儲藏,2010,39 (6):28-33

[3]朱星曄,韓育梅.過氧化氫酶的檢測方法及其在大米貯藏中的應用[J].農產品加工·學刊,2010(8):103-105

[6]程魯京,孟澤.鉬酸銨顯色法測定血清過氧化氫酶[J].臨床檢驗雜志,1994,12(1):6-8

[7]薛細平,陳榮,趙一兵,等.過氧化氫酶的熒光法測定及其在海洋環境污染評估中的應用[J].廈門大學學報:自然科學版,2003,42(1):83-86

[8]譚亞芳,孫樹秦,賴炳森.一種優化的測定過氧化氫酶活性的方法[J].生物技術,2001,11(5):39-41

[9]秦社彩.生物農醫領域中的酶活性單位[J].科技與出版,1999(2):24-25

[10]鐘傳欣.酶活力的量和單位的用法探討[J].貴州教育學院學報:自然科學版,2008,19(12):73-74

[11]何揚舉,董邦權,潘伯榮.kat是酶活性的SI單位[J].編輯學報,2004,16(1):30

[12]中國高等學校自然科學學報研究會編.中國高等學校自然科學學報編排規范[M].北京:北京工業大學出版社,1993:54.