堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白代謝的研究

樊丁才　王富生　王志遠(yuǎn)

[摘要] 目的 探討堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白代謝的影響。方法 選擇2012年1～10月我院收治的20例增生性瘢痕組織患者，手術(shù)切除組織留取和制作標(biāo)本，選擇不同濃度的bFGF對(duì)標(biāo)本進(jìn)行干預(yù)，分別測(cè)定標(biāo)本羥脯氨酸（HPr）、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白（CoI 、CoⅢ）mRNA的變化，并記錄對(duì)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶 1（MMP-1）的調(diào)控作用。 結(jié)果 0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組，HPr、CoI 、CoⅢmRNA變化不明顯，組間均無明顯差異（均P>0.05）；0 pg/L組MMP-1為（22.21±2.52） μg/L，明顯低于其他三組，100 pg/L組MMP-1為（35.62±3.23） μg/L，明顯高于其他三組，為含量最高組，可看出，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯。結(jié)論 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)CoI 、CoⅢ、HPr含量影響不顯著，不會(huì)促進(jìn)瘢痕組織形成，同時(shí)可增加MMP-1含量，發(fā)揮對(duì)膠原蛋白的降解作用。

[關(guān)鍵詞] 增生性瘢痕組織；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；瘢痕成纖維細(xì)胞；羥脯氨酸

[中圖分類號(hào)] R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）12-0001-03

[Abstract] Objective To study the effect of basic fibroblast growth factor （bFGF） hypertrophic scar fibroblasts Ⅰ， Ⅲ collagen metabolism. Methods 20 cases of hypertrophic scar patients were selected from January to October 2012 years in our hospital， operation excision tissue specimens and made specimen， different concentrations of bFGF intervention on specimens， hydroxyproline（HPr）， mRNA changed of type I and type III collagen（CoI， CoⅢ）of specimens were measured ， and recorded the regulation of cell matrix metalloproteinase 1（MMP-1）. Results 0 pg/L group， 50 pg/L group，100 pg/L group and the 500 pg/L group， HPr， CoI， CoⅢ mRNA did not change significantly， there was no significant difference between groups（P<0.05）； MMP-1 was（22.21±2.52） μg/L in 0 pg/L group， significantly lower than the other three groups， MMP-1 was（35.62±3.23） μg/ L in100 pg/L group ， significantly higher than the other three groups， as the highest group， can be seen， MMP-1 content increased with the increase of the bFGF concentrations ， and in the 100 pg/L concentration， increasing was most obvious. Conclusion Basic fibroblast growth factor is not significant for CoI， CoⅢ， HPr content， do not promote the formation of scar tissue， and can increase the content of MMP-1 and play the degradation of collagen.

[Key words] Hypertrophic scar； Fibroblast growth factor； Fibroblast； Hydroxyproline

燒傷患者的創(chuàng)面愈合主要與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）有關(guān)，通過調(diào)控作用發(fā)揮多種生理功能，是臨床運(yùn)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的重要多肽因子，可人工合成。有研究稱，瘢痕增生程度明顯降低，可能與bFGF降解CoI 、CoⅢ有關(guān)[1]。為進(jìn)一步研究bFGF對(duì)增生性瘢痕的代謝影響以及調(diào)控機(jī)制，本文研究其與瘢痕相關(guān)因子CoI、CoⅢ、HPr等水平的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

20例燒傷類患者于2012年1～10月由本院收治，手術(shù)治療時(shí)切除的瘢痕組織作為研究標(biāo)本進(jìn)行收集，并已經(jīng)通過病理學(xué)鑒定，并且已經(jīng)證實(shí)瘢痕組織處于增生活躍期。患者年齡22～49歲，平均（37.5±4.5）歲。男∶女為11∶9，瘢痕增生平均時(shí)間為傷后（17.4±4.2）個(gè)月。患者未患有造成結(jié)締組織代謝異常的原發(fā)病，排除器官功能損傷的慢性疾病，標(biāo)本采集2個(gè)月內(nèi)未服用任何藥物，未接受放療等治療。

1.2方法

1.2.1瘢痕成纖維細(xì)胞（Fb）的培養(yǎng)與鑒定 取患者瘢痕組織，將皮下脂肪組織徹底去除后進(jìn)行組織塊制作和培養(yǎng)。組織塊體積為0.5 mm3，選擇適宜濕溫度條件，選用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。待3周左右，培養(yǎng)細(xì)胞覆蓋瓶底后，以正確方法傳代并鑒定，將第2代細(xì)胞鑒定出，作為實(shí)驗(yàn)樣本。

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將生長(zhǎng)較好的細(xì)胞選出，調(diào)整細(xì)胞濃度并接種于孔板上。將其隨機(jī)分為4組，將不同濃度的bFGF加入細(xì)胞中，濃度分別為0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組。同時(shí)加入2 mL DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.2.3測(cè)定HPr、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白（CoⅠ 、CoⅢ）mRNA以及MMP-1 ①HPr的測(cè)定：取培養(yǎng)液上清，應(yīng)用氯胺T法測(cè)定。將0.1 mLHPr加入測(cè)定管，空白管調(diào)零，讀取吸光度。②CoI 、CoⅢmRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR方法，先提取總RNA，計(jì)算其總純、濃度，再取少量（1 μg）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得出cDNA，進(jìn)行保存。用PCR產(chǎn)物得出mRNA結(jié)果，m RNA相對(duì)含量=PCR產(chǎn)物（GADPH吸光度×面積）。③MMP-1檢測(cè)：應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)，通過熒光放射顯像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)與鑒定瘢痕Fb的結(jié)果

經(jīng)Massion 方法對(duì)所選組織進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)排列紊亂的膠原纖維，并且見不同程度新血管形成，均符合增生性瘢痕特點(diǎn)。對(duì)原代組織塊培養(yǎng)4～6 d，可發(fā)現(xiàn)萌出的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而加快生長(zhǎng)速度，并進(jìn)行傳代。隨后見排列整齊、旋渦狀走行的傳代Fb。經(jīng)免疫熒光染色后，包質(zhì)呈鮮紅色，表明均為成纖維細(xì)胞。分別見圖1～3。

2.2 不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子下，CoI 、CoⅢ、HPr以及MMP-1的變化

0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組，HPr、CoI 、CoⅢmRNA變化不明顯，組間均無明顯差異（均P>0.05）；0 pg/L組MMP-1為（22.21±2.52） μg/L，明顯低于其他三組，100 pg/L組MMP-1為（35.62±3.23） μg/L，明顯高于其他三組，為含量最高組，可看出，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯。見表1。

3 討論

成纖維細(xì)胞（FB）在創(chuàng)傷結(jié)締組織恢復(fù)過程中起到主導(dǎo)作用，是愈合的關(guān)鍵所在。bFGF能夠促進(jìn)FB增殖，發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的功能，但是相關(guān)具體機(jī)制并未得到證實(shí)[2]。不過大量研究已經(jīng)表明，bFGF調(diào)節(jié)作用強(qiáng)而穩(wěn)定，可趨化增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，偏向正常生物學(xué)特性，穩(wěn)定其表現(xiàn)型。具體機(jī)制中其對(duì)MMP-1的促進(jìn)作用已經(jīng)被多位研究者證實(shí)[3]，本文結(jié)果表明，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯，MMP-1含量明顯受到bFGF的影響，并且具有濃度依賴性。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM ）是MMP-1的主要降解對(duì)象，前者在增生性瘢痕形成過程中起到主要作用，主要成分為CoI 、CoⅢ，ECM的異常沉積，推進(jìn)瘢痕組織塑形[4]，因此，需要bFGF對(duì)ECM的降解調(diào)控作用抑制瘢痕組織形成。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，bFGF對(duì)羥脯氨酸的影響并不明顯，各濃度組間HPr水平比較，P>0.05。羥脯氨酸也是瘢痕組織膠原蛋白的構(gòu)成成分之一，是膠原纖維特有成分，因此在反應(yīng)瘢痕增生程度上具有較高特異性和靈敏性，但是其含量穩(wěn)定性較強(qiáng)[5]。同時(shí)，CoI、CoⅢ含量也并未因?yàn)椴煌瑵舛萣FGF的干預(yù)而發(fā)生顯著變化，此結(jié)果表明，bFGF并不是通過促進(jìn)膠原蛋白合成而發(fā)揮作用，而是通過抑制ECM沉積，抑制瘢痕形成。另外，有學(xué)者認(rèn)為[6-7]，個(gè)體差異較大，導(dǎo)致膠原蛋白合成因來源不同而造成明顯影響，因此，瘢痕形成也與個(gè)體差異有關(guān)[8-12]。

總之，通過以上分析，掌握bFGF與CoI、CoⅢ、HPr、MMP-1等水平的關(guān)系，進(jìn)一步了解bFGF促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)，對(duì)增生性瘢痕組織的影響和機(jī)制，從而為引導(dǎo)臨床治療，為進(jìn)一步預(yù)防瘢痕組織增生提供臨床指標(biāo)，增加臨床診治和預(yù)防的可靠性和準(zhǔn)確性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 胡亞蘭，郭樹忠，魯開化，等. bFGF和硫糖鋁在組織擴(kuò)張術(shù)中的應(yīng)用[J]. 中華整形外科雜志，2010，19（6）：43-45.

[2] 劉偉良，褚言琛，劉偉莉，等. 串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響及其與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的關(guān)系[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（4）：804-807.

[3] 陳辦成，涂平，倪春雅，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)皮膚萎縮性瘢痕中成纖維細(xì)胞的作用[J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2010，26（11）：980-982.

[4] 孫明岳，鄒云雯，褚言琛，等. 干擾串珠素表達(dá)對(duì)硬膜外瘢痕細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白生成的影響[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志，2013，15（4）：331-333.

[5] Weng J，Zhang H. A study of the expression of PCNA and the proliferation of bovine lens epithelial cell induced by bFGF[J]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2012，38（3）：176-179.

[6] 張曉玲，張寶林. rhbFGF和rhEGF對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，30（12）：435-436.

[7] 謝舉臨，卞輝寧，祁少海，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 中華損傷與修復(fù)雜志，2010，2（1）：26-29.

[8] 鄭彬，孫峰，趙戈，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染對(duì)鼠胎肝干細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化作用[J]. 中華移植雜志，2013，7（2）：89-93.

[9] 徐揚(yáng)陽，姜南，楊柳，等. 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人脂肪干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2013，19（2）：134-137.

[10] 馬杰，李艷. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠治療燒傷患者供皮區(qū)創(chuàng)面的療效觀察[J]. 中華燒傷雜志，2013， 29（2）：205-207.

[11] 薛杉，吳鋼，祝愛萍，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微球促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12（8）：769-773.

[12] 許麗，范偉偉，黃志峰，等. 復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子膠原蛋白緩釋載體促進(jìn)早期兔下頜骨缺損修復(fù)的研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志，2013，1（14）：6472-6476.

（收稿日期：2013-12-24）

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將生長(zhǎng)較好的細(xì)胞選出，調(diào)整細(xì)胞濃度并接種于孔板上。將其隨機(jī)分為4組，將不同濃度的bFGF加入細(xì)胞中，濃度分別為0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組。同時(shí)加入2 mL DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.2.3測(cè)定HPr、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白（CoⅠ 、CoⅢ）mRNA以及MMP-1 ①HPr的測(cè)定：取培養(yǎng)液上清，應(yīng)用氯胺T法測(cè)定。將0.1 mLHPr加入測(cè)定管，空白管調(diào)零，讀取吸光度。②CoI 、CoⅢmRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR方法，先提取總RNA，計(jì)算其總純、濃度，再取少量（1 μg）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得出cDNA，進(jìn)行保存。用PCR產(chǎn)物得出mRNA結(jié)果，m RNA相對(duì)含量=PCR產(chǎn)物（GADPH吸光度×面積）。③MMP-1檢測(cè)：應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)，通過熒光放射顯像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)與鑒定瘢痕Fb的結(jié)果

經(jīng)Massion 方法對(duì)所選組織進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)排列紊亂的膠原纖維，并且見不同程度新血管形成，均符合增生性瘢痕特點(diǎn)。對(duì)原代組織塊培養(yǎng)4～6 d，可發(fā)現(xiàn)萌出的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而加快生長(zhǎng)速度，并進(jìn)行傳代。隨后見排列整齊、旋渦狀走行的傳代Fb。經(jīng)免疫熒光染色后，包質(zhì)呈鮮紅色，表明均為成纖維細(xì)胞。分別見圖1～3。

2.2 不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子下，CoI 、CoⅢ、HPr以及MMP-1的變化

0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組，HPr、CoI 、CoⅢmRNA變化不明顯，組間均無明顯差異（均P>0.05）；0 pg/L組MMP-1為（22.21±2.52） μg/L，明顯低于其他三組，100 pg/L組MMP-1為（35.62±3.23） μg/L，明顯高于其他三組，為含量最高組，可看出，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯。見表1。

3 討論

成纖維細(xì)胞（FB）在創(chuàng)傷結(jié)締組織恢復(fù)過程中起到主導(dǎo)作用，是愈合的關(guān)鍵所在。bFGF能夠促進(jìn)FB增殖，發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的功能，但是相關(guān)具體機(jī)制并未得到證實(shí)[2]。不過大量研究已經(jīng)表明，bFGF調(diào)節(jié)作用強(qiáng)而穩(wěn)定，可趨化增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，偏向正常生物學(xué)特性，穩(wěn)定其表現(xiàn)型。具體機(jī)制中其對(duì)MMP-1的促進(jìn)作用已經(jīng)被多位研究者證實(shí)[3]，本文結(jié)果表明，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯，MMP-1含量明顯受到bFGF的影響，并且具有濃度依賴性。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM ）是MMP-1的主要降解對(duì)象，前者在增生性瘢痕形成過程中起到主要作用，主要成分為CoI 、CoⅢ，ECM的異常沉積，推進(jìn)瘢痕組織塑形[4]，因此，需要bFGF對(duì)ECM的降解調(diào)控作用抑制瘢痕組織形成。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，bFGF對(duì)羥脯氨酸的影響并不明顯，各濃度組間HPr水平比較，P>0.05。羥脯氨酸也是瘢痕組織膠原蛋白的構(gòu)成成分之一，是膠原纖維特有成分，因此在反應(yīng)瘢痕增生程度上具有較高特異性和靈敏性，但是其含量穩(wěn)定性較強(qiáng)[5]。同時(shí)，CoI、CoⅢ含量也并未因?yàn)椴煌瑵舛萣FGF的干預(yù)而發(fā)生顯著變化，此結(jié)果表明，bFGF并不是通過促進(jìn)膠原蛋白合成而發(fā)揮作用，而是通過抑制ECM沉積，抑制瘢痕形成。另外，有學(xué)者認(rèn)為[6-7]，個(gè)體差異較大，導(dǎo)致膠原蛋白合成因來源不同而造成明顯影響，因此，瘢痕形成也與個(gè)體差異有關(guān)[8-12]。

總之，通過以上分析，掌握bFGF與CoI、CoⅢ、HPr、MMP-1等水平的關(guān)系，進(jìn)一步了解bFGF促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)，對(duì)增生性瘢痕組織的影響和機(jī)制，從而為引導(dǎo)臨床治療，為進(jìn)一步預(yù)防瘢痕組織增生提供臨床指標(biāo)，增加臨床診治和預(yù)防的可靠性和準(zhǔn)確性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 胡亞蘭，郭樹忠，魯開化，等. bFGF和硫糖鋁在組織擴(kuò)張術(shù)中的應(yīng)用[J]. 中華整形外科雜志，2010，19（6）：43-45.

[2] 劉偉良，褚言琛，劉偉莉，等. 串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響及其與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的關(guān)系[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（4）：804-807.

[3] 陳辦成，涂平，倪春雅，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)皮膚萎縮性瘢痕中成纖維細(xì)胞的作用[J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2010，26（11）：980-982.

[4] 孫明岳，鄒云雯，褚言琛，等. 干擾串珠素表達(dá)對(duì)硬膜外瘢痕細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白生成的影響[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志，2013，15（4）：331-333.

[5] Weng J，Zhang H. A study of the expression of PCNA and the proliferation of bovine lens epithelial cell induced by bFGF[J]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2012，38（3）：176-179.

[6] 張曉玲，張寶林. rhbFGF和rhEGF對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，30（12）：435-436.

[7] 謝舉臨，卞輝寧，祁少海，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 中華損傷與修復(fù)雜志，2010，2（1）：26-29.

[8] 鄭彬，孫峰，趙戈，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染對(duì)鼠胎肝干細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化作用[J]. 中華移植雜志，2013，7（2）：89-93.

[9] 徐揚(yáng)陽，姜南，楊柳，等. 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人脂肪干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2013，19（2）：134-137.

[10] 馬杰，李艷. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠治療燒傷患者供皮區(qū)創(chuàng)面的療效觀察[J]. 中華燒傷雜志，2013， 29（2）：205-207.

[11] 薛杉，吳鋼，祝愛萍，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微球促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12（8）：769-773.

[12] 許麗，范偉偉，黃志峰，等. 復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子膠原蛋白緩釋載體促進(jìn)早期兔下頜骨缺損修復(fù)的研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志，2013，1（14）：6472-6476.

（收稿日期：2013-12-24）

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將生長(zhǎng)較好的細(xì)胞選出，調(diào)整細(xì)胞濃度并接種于孔板上。將其隨機(jī)分為4組，將不同濃度的bFGF加入細(xì)胞中，濃度分別為0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組。同時(shí)加入2 mL DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.2.3測(cè)定HPr、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白（CoⅠ 、CoⅢ）mRNA以及MMP-1 ①HPr的測(cè)定：取培養(yǎng)液上清，應(yīng)用氯胺T法測(cè)定。將0.1 mLHPr加入測(cè)定管，空白管調(diào)零，讀取吸光度。②CoI 、CoⅢmRNA表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR方法，先提取總RNA，計(jì)算其總純、濃度，再取少量（1 μg）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得出cDNA，進(jìn)行保存。用PCR產(chǎn)物得出mRNA結(jié)果，m RNA相對(duì)含量=PCR產(chǎn)物（GADPH吸光度×面積）。③MMP-1檢測(cè)：應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)，通過熒光放射顯像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)與鑒定瘢痕Fb的結(jié)果

經(jīng)Massion 方法對(duì)所選組織進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)排列紊亂的膠原纖維，并且見不同程度新血管形成，均符合增生性瘢痕特點(diǎn)。對(duì)原代組織塊培養(yǎng)4～6 d，可發(fā)現(xiàn)萌出的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而加快生長(zhǎng)速度，并進(jìn)行傳代。隨后見排列整齊、旋渦狀走行的傳代Fb。經(jīng)免疫熒光染色后，包質(zhì)呈鮮紅色，表明均為成纖維細(xì)胞。分別見圖1～3。

2.2 不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子下，CoI 、CoⅢ、HPr以及MMP-1的變化

0 pg/L組、50 pg/L組、100 pg/L組、500 pg/L組，HPr、CoI 、CoⅢmRNA變化不明顯，組間均無明顯差異（均P>0.05）；0 pg/L組MMP-1為（22.21±2.52） μg/L，明顯低于其他三組，100 pg/L組MMP-1為（35.62±3.23） μg/L，明顯高于其他三組，為含量最高組，可看出，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯。見表1。

3 討論

成纖維細(xì)胞（FB）在創(chuàng)傷結(jié)締組織恢復(fù)過程中起到主導(dǎo)作用，是愈合的關(guān)鍵所在。bFGF能夠促進(jìn)FB增殖，發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的功能，但是相關(guān)具體機(jī)制并未得到證實(shí)[2]。不過大量研究已經(jīng)表明，bFGF調(diào)節(jié)作用強(qiáng)而穩(wěn)定，可趨化增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，偏向正常生物學(xué)特性，穩(wěn)定其表現(xiàn)型。具體機(jī)制中其對(duì)MMP-1的促進(jìn)作用已經(jīng)被多位研究者證實(shí)[3]，本文結(jié)果表明，MMP-1含量隨著堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度的增加而不斷上升，并且在100 pg/L濃度時(shí)，上升最明顯，MMP-1含量明顯受到bFGF的影響，并且具有濃度依賴性。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM ）是MMP-1的主要降解對(duì)象，前者在增生性瘢痕形成過程中起到主要作用，主要成分為CoI 、CoⅢ，ECM的異常沉積，推進(jìn)瘢痕組織塑形[4]，因此，需要bFGF對(duì)ECM的降解調(diào)控作用抑制瘢痕組織形成。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，bFGF對(duì)羥脯氨酸的影響并不明顯，各濃度組間HPr水平比較，P>0.05。羥脯氨酸也是瘢痕組織膠原蛋白的構(gòu)成成分之一，是膠原纖維特有成分，因此在反應(yīng)瘢痕增生程度上具有較高特異性和靈敏性，但是其含量穩(wěn)定性較強(qiáng)[5]。同時(shí)，CoI、CoⅢ含量也并未因?yàn)椴煌瑵舛萣FGF的干預(yù)而發(fā)生顯著變化，此結(jié)果表明，bFGF并不是通過促進(jìn)膠原蛋白合成而發(fā)揮作用，而是通過抑制ECM沉積，抑制瘢痕形成。另外，有學(xué)者認(rèn)為[6-7]，個(gè)體差異較大，導(dǎo)致膠原蛋白合成因來源不同而造成明顯影響，因此，瘢痕形成也與個(gè)體差異有關(guān)[8-12]。

總之，通過以上分析，掌握bFGF與CoI、CoⅢ、HPr、MMP-1等水平的關(guān)系，進(jìn)一步了解bFGF促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)，對(duì)增生性瘢痕組織的影響和機(jī)制，從而為引導(dǎo)臨床治療，為進(jìn)一步預(yù)防瘢痕組織增生提供臨床指標(biāo)，增加臨床診治和預(yù)防的可靠性和準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2013-12-24）