不可逆電穿孔消融兔膽囊側肝臟病理學觀察

梁冰，牛立志，曾健瀅，周亮，周序瓏，方剛，姚飛，鄧春娟，汪媛，張波，李書英，鄧春梅，楊惠霏，李家亮，劉建國，徐克成

·實驗研究Experimental research·

不可逆電穿孔消融兔膽囊側肝臟病理學觀察

梁冰，牛立志，曾健瀅，周亮，周序瓏，方剛，姚飛，鄧春娟，汪媛，張波，李書英，鄧春梅，楊惠霏，李家亮，劉建國，徐克成

目的研究靠近膽囊0.5 cm處不可逆電穿孔肝臟消融的安全性和有效性。方法采用新西蘭白兔3只作為實驗動物，在靠近膽囊0.5 cm處肝臟進行不可逆電穿孔消融，并于7 d后觀察消融區域的肝臟病理反應和膽囊損傷情況。結果3只動物均成功完成消融。消融7 d后，肝臟面原消融區平均直徑3.00 cm黃色壞死灶，肝膈面形成1個平均直徑1.67 cm類圓形黃色壞死灶。2只實驗兔消融部位和腹壁、1只肝葉和膈肌發生小片段淺度粘連。2只腸系膜則與膽囊消融灶區發生嚴重粘連。光鏡下可見肝大片壞死且消失，僅有部分凝固性壞死肝組織殘留，外圍有少量斑點狀鈣化，炎性肉芽組織和小膽管顯著增生。肝門靜脈血管平滑肌損傷不明顯，肌層小范圍纖維素樣變性、膽囊黏膜上皮大部分壞死，膽囊外結締組織水腫、膽總管部分黏膜上皮壞死，部分上皮仍存在，肌層完好。結論消融部位肝臟組織完全壞死，消融灶和周圍組織分界明顯，膽囊出現損傷，但無膽囊漏發生。因此，對于靠近膽囊的肝臟腫瘤而言，不可逆電穿孔可能是一種相對安全有效的選擇。

肝臟；不可逆電穿孔消融；膽囊；兔

我國是原發性肝癌的高發國家，病死率占惡性腫瘤的第2位［1］。腫瘤手術切除是目前肝癌患者獲得長期生存乃至根治的主要方法之一，但能獲得手術切除的患者低于20%。對于不可切除的肝癌，化療已成為最主要的治療手段，但由于可能的不良反應，化療的療效仍然有限。近年來，微創外科和腫瘤局部治療的興起為肝癌的治療開辟了新的方向。目前，射頻消融［2］、微波消融［3］、冷凍消融［4］和不可逆電穿孔［5］都已成功用于治療肝癌。其中，不可逆電穿孔是最近剛開始在臨床應用的腫瘤消融新技術，該技術利用高壓直流電發出的強大電場的作用，在細胞膜上產生多個細孔從而不可逆轉地破壞細胞，導致即時腫瘤細胞死亡［6-7］。由于消融產生在細胞膜上的細孔為納米級別的空洞，該技術又被稱為納米刀。對于肝臟腫瘤消融，對靠近隔膜穹頂第一肝門和鄰近膽囊部位的腫瘤進行消融，由于可能會引發嚴重的并發癥，一直是經皮穿刺消融肝臟腫瘤的難點甚至是禁忌［8］。由于不可逆電穿孔具有消融范圍明確、消融時間短、對神經和血管具有保護作用的優點，在肝臟肝門和膽囊等關鍵部位的消融可能具有一定優勢。因此，本研究在白兔肝臟靠近膽囊0.5 cm處進行不可逆電穿孔消融，觀察消融7 d后肝臟情況和膽囊的病理損傷，以探討不可逆電穿孔對于靠近膽囊的肝臟消融的有效性和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物雌性普通級新西蘭兔3只，體重2.5～30 kg，由南方醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號［SCXK（粵）2011-0015］，動物合格證號［粵監證字44002100000654］。

1.1.2 主要實驗器械和藥品試劑AngioDynamics納米刀系統（美國AngioDynamics公司），包括主機、長15 cm和有效距離0～4 cm的納米刀電探針（美國AngioDynamics公司，批號20400104）；監護儀（荷蘭Philips公司，型號M8001A），ID3.0氣管導管購自泰科醫療器材國際貿易（上海）有限公司（批號為11004113042）、ENT-1001嬰兒型呼吸囊購自臺灣-彥大有限公司（批號為20100426）、阿托品購自天津藥業集團新鄭股份有限公司（批號為715765U），鹽酸氯胺酮注射液購至福建古田藥業有限公司（批號為H35020148）。鹽酸戊己奎醚（長托寧）注射液購至城都力思特制藥（批號為120607）公司，維庫溴銨粉針劑購自浙江仙琚藥業（批號為130303），硫酸阿托品注射液購自徐州萊恩藥業（批號為1211112），新斯的明注射液購自上海信誼金朱藥業（批號120802）。

1.2 方法

1.2.1 術前準備及麻醉動物禁食24 h，禁水12 h。術前在實驗兔腿部肌內注射阿托品（0.02mg/kg）及鹽酸氯胺酮注射液（44 mg/kg）誘導麻醉后，家兔仰臥位固定，在劍骨突后緣至恥骨前緣備皮，行氣管切開后置入ID 3.0號氣管導管，肌內注射維庫溴銨0.12mg/kg。選用嬰兒型呼吸囊控制呼吸，控制潮氣量為50 ml，呼吸頻率為30～50次/min，呼吸比為1∶1和氧分壓為100%。開腹前按體重44mg/kg后腿肌肉注射氯胺酮注射液以維持麻醉。手術結束，自肌內注射維庫溴銨30min后給予阿托品、新斯的明各0.1 mg拮抗肌肉松弛，30 min重復1次。

1.2.2 納米刀消融步驟動物麻醉后開腹，暴露肝左上葉，直視下將納米刀電探針1（P+）和探針2（P-）垂直插入肝臟面0.5 cm，2針距離1.5 cm，使與膽囊壁距離為0.5 cm，設置探針有效距離為0.5 cm，起始電壓為2 250 V、脈沖長度70 ms和數字脈沖90 Hz后啟動系統，消融術程約1 min，電擊結束后拔出探針即完成納米刀消融術。于消融區兩端各置一縫線作為標記后結束手術，將臟器回納腹腔，常規閉腹，待實驗動物蘇醒后自由飲食，護理期間不給予藥物。

1.2.3 術中與術后觀察術中觀察電消融時肝臟及膽囊表面形態變化，用游標卡尺測量并記錄組織表面消融區域最大半徑。術后第7天對實驗兔實行安樂死，觀察肝臟與膽囊消融區域及周邊臟器形態變化。

1.2.4 病理檢查取組織標本置甲醛中固定24 h以上，石蠟包埋，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，連續切片，厚度5μm，常規蘇木精-伊紅（HE）染色，封片后鏡下觀察。

1.3 統計學處理

采用Graphpad Prism 5（GraphPad，USA）軟件進行統計學分析。計量數據用平均值±標準偏差（x± s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術中與術后消融區形態觀察

2.1.1 術中肝臟及膽囊形態變化消融過程中未見肝臟和膽囊表面有顯著外觀改變（圖1a），消融結束后肝消融區顏色略深，邊緣不清晰，穿刺部位有少量出血，周圍組織形態及顏色無異常（圖1b）。

2.1.2 術后消融區域及周邊臟器形態變化消融7 d后肝膈面原消融區可見一8字型黃色壞死灶，表面最大徑平均為3.00 cm，外周有一圈淡粉紅色的分隔帶，與周圍組織分界明顯（圖1c）；肝臟面形成一類圓形黃色壞死灶（圖1d），表面最大徑平均為1.67 cm。將壞死灶以術中消融區兩端縫線作連線，垂直肝葉剖開后，可見壞死灶全層貫穿左肝葉，其他區域肝臟組織未見異常。靠近肝消融區一側膽囊壁顏色變淺，發白。

圖1 不可逆電穿孔肝臟消融過程

2.1.3 粘連情況2只實驗兔腹壁、1只肝葉和膈肌與肝膈面消融區發生小片段淺度粘連。2只腸系膜則與膽囊消融灶區發生嚴重粘連。

2.2 病理組織學觀察

2.2.2 肝消融區7 d后組織學觀察光鏡下可見肝組織大片壞死消失，僅有部分凝固性壞死肝組織輪廓殘留，外圍有少量斑點狀鈣化，炎性肉芽組織和殘留小膽管顯著增生（圖2）。

圖2 兔肝臟消融7 d后組織學所見（HE，×400）

2.2.3 肝門靜脈、膽囊和膽總管消融7 d后組織學觀察①肝門靜脈血管平滑肌損傷不明顯，肌層損傷不理想，小范圍纖維素樣變性（圖3a）。②膽囊黏膜層上皮大部分壞死脫落，小部分仍存在，肌層損傷不明顯，膽囊漿膜層充血水腫，少量炎細胞浸潤（圖3b）。③膽總管部分黏膜上皮壞死，部分上皮仍存在，漿膜層充血水腫，少量炎性細胞浸潤（圖3c）。

3 討論

不可逆電穿孔是2012年4月美國FDA批準應用于臨床的腫瘤消融新技術。該技術具有以下特點：①不可逆電穿孔可通過誘導細胞凋亡，引發腫瘤組織壞死［9-11］。②與已有的熱消融技術如射頻消融、微波消融和冷凍消融不同，不可逆電穿孔無需熱能，通過改變細胞膜通透性即可導致組織死亡。因此，該法不受熱沉效應影響。③不可逆電穿孔可在消融區和非消融區產生明顯的邊界，這將最大可能的減少對腫瘤組織的損傷，減少并發癥的發生。④消融時間短。與傳統消融技術（30min～數小時）相比，不可逆電穿孔可在微秒到毫秒治療時間內有效導致組織死亡。非熱細胞死亡及治療時間顯著減少。⑤對神經和大血管的保護作用［12-15］。這使不可逆電穿孔可以在富含大血管或神經的部位消融腫瘤，而不用擔心并發癥的發生。因此，由于不可逆電穿孔的上述優勢，該方法已在肝癌消融方面進行了初步的臨床應用，并顯示出非常廣闊的應用前景［16-17］。

圖3 膽囊、肝門靜脈、膽囊消融7 d后病理學觀察（HE，×40）

由于肝臟組織血供較為豐富，局部微環境差異較大，不同的消融程序對于消融效果影響較大。由于不可逆電穿孔沒有“熱沉”效應，該技術在治療接近血管的腫瘤上獨具優勢［18］。但是，由于不可逆電穿孔的研究尚處于初級階段，其消融肝臟腫瘤的適應證和禁忌證尚未深入研究。對于不可逆電穿孔來說，靠近膈膜穹頂，第一肝門和鄰近膽囊部位的腫瘤消融，也可能會引發膈肌穿孔或膽囊漏發生，需要對其進行深入系統研究。本研究利用新西蘭白兔模型，在白兔肝臟靠近膽囊處0.5 cm處進行不可逆電穿孔消融，觀察7 d后肝臟的消融情況和膽囊的病理損傷，以探討不可逆電穿孔對于靠近膽囊的肝臟消融的有效性和安全性。本次研究發現，消融7 d后肝臟面原消融區3.00 cm黃色壞死灶，肝膈面形成1個1.67 cm類圓形黃色壞死灶。外周有一圈淡粉紅色的分隔帶，與周圍組織分界明顯。2只實驗兔消融部位和腹壁、1只肝葉和膈肌發生小片段淺度粘連。光鏡下可見肝大片壞死且消失，僅有部分凝固性壞死肝組織殘留，外圍有少量斑點狀鈣化，炎性肉芽組織和小膽管顯著增生。肝門靜脈血管平滑肌損傷不明顯，肌層小范圍纖維素樣變性、膽囊黏膜上皮大部分壞死，膽囊外結締組織水腫、膽總管部分黏膜上皮壞死，部分上皮仍存在，肌層完好。2只兔腸系膜則與膽囊消融灶區發生嚴重粘連。因此，從目前的結果來看，不可逆電穿孔靠近膽囊0.5 cm消融肝臟，肝臟組織壞死明確，膽囊出現明確損傷，但沒有膽囊漏發生。

總之，本研究對肝臟靠近膽囊0.5 cm處進行不可逆電穿孔消融，以觀察該方法在臨床上靠近膽囊的肝臟腫瘤消融的安全性和有效性。結果顯示，消融部位肝臟組織完全壞死，消融灶和周圍組織分界明顯，膽囊出現損傷，但沒有膽囊漏發生。因此，對于靠近膽囊的肝臟腫瘤來說，不可逆電穿孔可能是一種相對安全有效的選擇。還需要對該技術作進一步研究，以在治療時正確選擇患者，減少潛在并發癥的發生，從而明確不可逆電穿孔的適應范圍和臨床應用價值。

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Irreversible electroporation ab lation of the hepatic region close to the gallbladder：pathological

observation in experimental rabbits

LIANG Bing，NIU Li-zhi，ZENG Jian-ying，ZHOU Liang，ZHOU

Xu-long，FANG Gang，YAO Fei，DENG Chun-juan，WANG Yuan，ZHANG Bo，LI Shu-ying，DENG Chun-mei，YANG Hui-fei，LI Jia-liang，LIU Jian-guo，XU Ke-cheng.Affiliated Fuda Cancer Hospital，School of Medicine，Ji’nan University，Guangzhou，Guangdong Province 510665，China

XU Ke-cheng，E-mail：fudalab@gmail.com

ObjectiveTo investigate the safety and efficacy of irreversible electroporation（IRE）ablation of hepatic region close（0.5 cm）to the gallbladder.MethodsThree New Zealand white rabbitswere used for this study.The IRE probes，which were p laced in the hepatic tissue，were 0.5 cm apart from the gallbladder，and IRE ablation was performed.Seven days after the treatment the pathological changes of the hepatic ablated zones and gallbladderswere exam ined.ResultsSuccessful IRE ablation was accomp lished in all 3 rabbits.Seven days after the treatment the experimental rabbits were sacrificed，and their livers and gallbladders were collected and sent for pathological examination.Macroscopically，the hepatic surface of the ablated area showed a yellow necrotic lesion，which was（3.00±0.50）cm in size.At the diaphragmatic surface of the liver a round yellow lesion was seen with a size about（1.67±1.15）cm.Slight superficial adhesion could be seen at the ablated areas and abdom inal wall（n=2），hepatic lobe（n=1）and diaphragm（n=1）.Serious adhesion ofmesentery with the ablated gallbladderwas seen in two rabbits.Microscopically，massive necrosis or disappearance of the hepatic tissue together with a little residual hepatic coagulation necrosis and speckled calcifications at the peripheral region could be detected.Inflammatory granulation and prom inent proliferation of the tiny biliary ductswere also observed.The damage of the vascular smoothmuscle in the portal vein was not obvious.Small area of fibrinoid degeneration was seen in the muscular layer.Mucosal epithelial necrosis of the gallbladder and connective tissue edema outside the gallbladder could also be observed. Conclusion Complete necrosis of the hepatictissue at the ablated area can be achieved by IRE ablation.The ablated zone has a clear demarcation with the surrounding tissue.No gallbladder leakage occurs although the gallbladder is damaged.Therefore，for the hepatic tumors，which are located close to the gallbladder，irreversible electroporation ablation may be regarded as a relatively safe and effective treatment.（JIntervent Radiol，2014，23：320-324）

liver；irreversible electroporation ablation；gallbladder；rabbit

R735.7

B

1008-794X（2014）-04-0320-05

2013-12-20）

（本文編輯：侯虹魯）

廣州天河區科技計劃項目（2013KW 051）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.04.012

510665廣州暨南大學醫學院附屬復大腫瘤醫院

徐克成E-mail：fudalab@gmail.com