肝細胞癌患者TACE術前后血清miR-21表達變化及臨床意義

王以浪，王亞非，張亮，繆亞軍，陳卓，周陳，印滇，丁文彬

·腫瘤介入Tumor intervention·

肝細胞癌患者TACE術前后血清miR-21表達變化及臨床意義

王以浪，王亞非，張亮，繆亞軍，陳卓，周陳，印滇，丁文彬

目的探討HCC患者經皮肝動脈化療栓塞（TACE）術前、后血清miR-21表達變化及臨床意義。方法以反轉錄定量PCR（RT-PCR）法檢測HCC患者TACE術前、后及正常者血清m iR-21水平，以酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清AFP水平。結果HCC患者血清miR-21水平為正常人的（12.9± 3.5）倍（t=19.430 7，P＜0.01），TACE術后1個月為正常參考值的（7.2±1.7）倍，較術前顯著降低（t= 9.493 7，P＜0.01）。血清miR-21水平與腫瘤大小、癌栓及HBV感染相關。TACE術后1個月血清miR-21水平在部分緩解、穩定和進展組中分別為正常人的（4.0±0.3）、（6.0±1.5）和（8.6±1.5）倍，各組間差異有統計學意義（F=38.168，P=0.000）。miR-21診斷HCC的ROC-AUC值為0.910±0.041，顯著高于AFP的0.860±0.037（t=6.304 2，P＜0.01）。miR-21檢測HCC的特異度（88.1%）顯著高于AFP（69.0%，χ2=4.525 3，P=0.033）。結論TACE術后m iR-21水平明顯降低，能較好預測TACE術療效，是HCC的潛在分子標記物。

肝細胞癌；經導管動脈化療栓塞術；miRNA-21；血清

肝細胞癌（HCC）進展快，臨床癥狀隱匿，診斷時病程多在晚期，喪失手術機會［1］。經導管選擇性肝動脈化療栓塞（TACE）是晚期HCC的首選療法［2-3］。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2009年1月—2012年12月我院診治的HCC患者42例，其中男34例，女8例；年齡為35～74歲，平均（53±9）歲。所有患者診斷符合《原發性肝癌規范化診治專家共識》［12］。腫瘤直徑≥5 cm 32例，＜5 cm 10例（多發腫瘤統計最大者直徑）；伴有門靜脈及分支癌栓34例，無癌栓8例。AFP≥400μg/L 16例，＜400μg/L 26例。HBsAg陽性36例，陰性6例。納入標準：初治患者，無手術切除指征，未接受化療、放療以及分子靶向治療；無TACE禁忌，肝功能Child-Pugh A～B級；總病灶占肝臟體積＜70%，門靜脈主干通暢。介入治療術中碘化油乳劑為：表阿霉素60mg、奧沙利鉑50 mg聯合碘化油混成乳劑（用量根據腫瘤大小及血供情況，總量不超過30m l）。TACE時將導管超選擇插入肝固有動脈以遠的腫瘤供血動脈，栓入碘化油乳劑。收集42例我院門診正常體檢者血清標本作為正常對照組。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-21反轉錄定量PCR法檢測抽取不同時期患者靜脈血各5 m l，加入含有EDTA試管中。離心，抽提總RNA（美國Molecular Research Cente公司）。合成第一鏈cDNA（以色列Fermentas公司）。miR-21和miR-16反轉錄定量PCR引物由上海英駿生物公司合成（表1）。采用EzOmicsTM一步實時反轉錄定量PCR法檢測血清miRNA（百奧邁科生物技術有限公司）。反轉錄定量PCR反應體系：50 ng RNA，qPCR混合物12.5μl，miRNA-21反轉錄引物（10μmol/L）0.5μl，miRNA-21正、反向引物各0.5μl（10μmol/L），RNA酶抑制劑，加ddH2O至25μl。每個樣本進行3次檢測取平均數。以miR-16為內參照基因，miR-21相對表達量采用2-ΔΔCt計算［8］。該方法是目的基因與內參基因的Ct值比較后（ΔCt），再將HCC組與正常組比較（ΔΔCt）。ΔCt=（CtmiR-21-CtmiR-16），ΔΔCt=［（CtmiR-21-CtmiR-16）HCC-（CtmiR-21-CtmiR-16）正常人］，2-ΔΔCt的數值反映血清miR-21相對于正常人血清水平的倍數（定量PCR擴增儀、凝膠成像分析儀和核酸蛋白分析儀購自美國Bio-Rad公司）。

表1 反轉錄定量PCR引物序列

1.2.2 ELISA法血清AFP定量檢測ELISA操作按說明書進行，用自動酶聯儀在450 nm波長測量各孔的A值。繪制標準曲線，計算各樣品中AFP的濃度。

1.2.3 療效評價方法所有患者均在術前1周內和治療后4周于本院接受CT（Siemens sensation 64排螺旋CT）或MR（Siemens symphony 3.0 T）多期掃描。用RECIST標準評價HCC治療后反應。包括完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、進展（PD）和穩定（SD）。CR指所有靶病灶消失，PR指靶病灶最大徑總和縮小30%以上，PD指靶病灶最大徑總和增加20%以上和（或）有新病灶出現，SD指病灶變化介于PD和PR之間。

1.3 統計學處理

您說像他這樣，我怎么敢把大事兒交給他辦？他自己也挺苦惱：“國家的事兒不歸我想，家里的事兒全被你想了，我還能想點兒啥？”

2 結果

2.1 RNA質量檢測及反轉錄定量PCR擴增

提取外周血總RNA，用紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，所測A值均在1.8～2.0之間。經1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA各條帶顯示清晰，合成第一鏈cDNA，以特異性引物對miR-21和miR-16進行實時熒光定量PCR反應，其擴增曲線見圖1。

圖1 反轉錄定量PCR擴增曲線

2.2 正常人群和HCC患者血清miR-21水平比較

各組血清miR-21水平見表2。HCC患者血清miR-21水平為正常人群的（12.9±3.5）倍，TACE術后1周血清miR-21水平較術前升高，術后1個月較術前降低。

表2 正常人群和HCC患者血清miR-21水平比較（±s）

表2 正常人群和HCC患者血清miR-21水平比較（±s）

注：與TACE術前1 d組比，a：t=19.430 7，P＜0.001；b：t=3.600 8，P＜0.001；c：t=9.493 7，P＜0.001

標志正常對照組（n=42）HCC組（n=42）術前1 d術后1周術后1個月miR-21 Ct 27.3±3.1 23.3±2.4 23.1±2.4 24.7±2.9 miR-16 Ct 24.6±2.4 24.3±2.2 24.4±2.6 23.6±2.2 2-ΔΔCt1.1±1.8a12.9±3.5 17.1±6.7b7.2±1.7c

2.3 HCC患者血清miR-21水平與臨床特征關系分析

對miR-21表達與臨床特征分析顯示（見表3），miR-21表達與腫瘤大小、有無癌栓及HBV感染相關，與腫瘤數目、AFP水平無相關性。

HCC患者介入術后1個月行CT或MRI檢查，以RECIST標準評價HCC患者介入術后近期療效，見表4。各組間miR-21水平差異有統計學意義，miR-21水平隨療效改善而降低。

表3 HCC患者血清miR-21水平與臨床特征分析（±s）

表3 HCC患者血清miR-21水平與臨床特征分析（±s）

注：a：t=1.387 4，P=0.173 0；b：t=4.840 1，P=0.000 0；c：t=5.776 6，P=0.000；d：t=0.783 4，P=0.438 0；e：t=5.856 2，P=0.000 0

參數例數miR-21 Ct miR-16Ct 2-ΔΔCt腫瘤數目單發10 23.4±2.4 24.3±2.5 12.9±3.1a多發32 23.2±2.2 24.3±2.0 14.9±4.2腫瘤直徑/cm≥5 32 23.1±2.1 24.3±2.2 16.0±3.7b＜5 10 23.7±2.3 24.2±2.6 9.8±2.9癌栓有34 23.1±1.9 24.5±2.3 18.4±4.9c無8 23.9±2.6 24.1±2.5 8.0±2.6 AFP/（μg/L）≥400 16 23.4±2.0 24.4±2.1 13.9±3.3d＜400 26 23.1±2.3 24.2±1.9 14.9±4.5 HBsAg陽性36 23.0±2.2 24.4±2.4 18.3±4.4e陰性6 23.9±2.5 24.0±2.1 7.5±2.1

表4 TACE術后miR-21水平與近期療效關系（±s）

表4 TACE術后miR-21水平與近期療效關系（±s）

注：F=38.168，P=0.000

療效（n）miR-21水平PR（9）4.1±0.3 SD（8）6.0±1.5 PD（25）8.6±1.5

2.5 HCC患者血miR-21與AFP檢測ROC曲線下面積（AUC）比較

以正常人群血清的miR-21與AFP表達水平為對照組，繪制ROC曲線（圖2）。miR-21 ROC AUC為0.910±0.041，顯著高于AFP的0.860±0.037（t=6.304 2，P＜0.01）。

圖2 miR-21與AFP的ROC

2.6 miR-21與AFP診斷HCC的靈敏度和特異度比較

取以正常人群為對照的ROC曲線約登指數最大點，確定miR-21和AFP診斷HCC的最佳臨界值分別為4.95倍和13.5μg/L。兩者診斷HCC靈敏度及特異度見表5。

3 討論

近來多項研究表明外周血miRNA可以作為惡性腫瘤的標記物，為研究腫瘤發病機制、早期診斷、臨床療效評估及監測復發、轉移提供了重要工具。

表5 miR-21與AFP診斷HCC的靈敏度和特異性比較

miRNA是一類非編碼的微小RNA，其與靶基因mRNA 3′非編碼區的堿基互補配對結合，通過多種途徑影響靶基因的表達而發揮生理、病理作用。其主要作用方式有：抑制mRNA翻譯；促使多聚核糖體脫落，抑制蛋白翻譯延伸；募集蛋白酶降解翻譯中的蛋白；促進mRNA降解［13］。miR-21靶基因包括數種抑癌基因，如p53、PTEN/AKT信號通路、RAS信號通路、FasL和TPM1等，miR-21可抑制靶基因表達，參與腫瘤細胞增殖、細胞周期調控、凋亡和侵襲轉移，起著癌基因的作用［14-15］。

miRNA在外周血中可以穩定存在，耐RNA酶降解，易被定量PCR等方法檢測到。本研究顯示HCC患者外周血中miR-21水平明顯高于正常人群，具有較高的診斷價值。有研究表明miR-21在HCC組織中的水平是癌旁組織的近3倍［16］。本文檢測miR-21表達水平相對較高可能與兩項研究標本分別是外周血及病理組織有關，此外，歐美國家HCC病因常見為HCV感染及酒精性脂肪肝等，而我國多為HBV感染。

AFP作為臨床最常用的HCC標記物，具有較高的靈敏度，但也存在30%左右的假陰性，此外慢性HBV患者及生殖系腫瘤患者AFP常增高，導致了部分假陽性。本文研究顯示HCC患者miR-21表達與AFP無明顯相關性，miR-21 ROC AUC為0.910，顯著高于AFP的0.860。miR-21和AFP診斷HCC的最佳臨界值分別為4.95和13.5μg/L，此時兩者檢測HCC均具有較高靈敏度（83.3%和95.2%），而特異度分別為88.1%和69.0%，miR-21明顯高于AFP。可見miR-21可與AFP在HCC診斷中起到互補作用，提高診斷準確率。

本研究顯示HBsAg陽性者外周血miR-21水平較HBsAg陰性者顯著增高。我國HCC患者90%以上為HBV相關性HCC，HBx蛋白在HBV誘發HCC形成過程中扮演了重要的作用［17-18］。HBx通過上調miR-21抑制凋亡基因表達，促進HCC形成［19］。此外，我們研究還發現腫瘤越大及伴有門靜脈癌栓者，其血清miRNA-21水平越高。可能與腫瘤負荷高，HCC細胞內成熟的miR-21被脂蛋白或脂質包被成外切酶體，主動分泌至胞外進入外周血液循環有關。

TACE術后1周外周血miR-21水平較術前增高，有研究表明TACE術后7～10 d出現HCC病灶明顯壞死，壞死HCC細胞內成熟的miR-21大量釋放到外周血中，致血miR-21水平明顯升高。TACE術后1個月miR-21較術前顯著降低，可能為HCC病灶TACE術后HCC細胞負荷減少，致外周血miR-21水平下降有關。提示TACE術后檢測患者血清miR-21來評估治療效果時間窗應該在1個月后。分析外周血miR-21水平與近期療效關系顯示，miR-21水平隨HCC病灶縮小、減少而降低，提示其可以作為TACE術療效監測指標。

綜上所述，本研究顯示HCC患者外周血miR-21水平明顯增高，與HBV感染、腫瘤大小及門脈癌栓相關，與AFP在診斷HCC中有互補作用，TACE術后miR-21水平明顯降低，能較好預測TACE術療效，可作為臨床診斷、治療HCC的潛在分子標記物。

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The changes of serum m iR-21 expression level in patientsw ith HCC before and after TACE and its clinical significance

WANG Yi-lang，WANG Ya-fei，ZHANG Liang，MIAO Ya-jun，CHEN Zhuo，ZHOU Chen，YIN Dian，DING Wen-bin.The First Peop le’s Hospital of Nantong，Natong，Jiangsu Province 226001，China

DINGWen-bin，E-mail:oncowang@163.com

ObjectiveTo investigate the changes of serum m iR-21 expression level in patients with HCC before and after transcatheter arterial chemoembolization（TACE）and to discuss its clinical significance.M ethods Before and after TACE the levels of serum miR-21 in 42 patients with HCC and 42 healthy subjectswere determined by reverse transcriptase quantitative PCR（RT-PCR），and the levels of serum AFP were also estimated by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The results were analyzed.Results The serum miR-21 level in patientswith HCC was（12.9±3.5）times of that in normal subjects（t=19.430 7，P＜0.01）.One month after TACE，the serum miR-21 level became（7.2±1.7）times of that of normal reference value，which was remarkably lower than thatobtained before the treatment（t=9.493 7，P＜0.01）.The serum miR-21 levelwas closely correlated with the tumor size，the presence of tumor thrombus and HBV infection.Onemonth after TACE the serum m iR-21 levels in patient groups showing partial response，stable disease and progressive diseasewere（4.0±0.3），（6.0±1.5）and（8.6±1.5）times，respectively，of that of normal reference value，and statistically significant difference existed between each other among the three groups（F=38.168，P=0.000）.ROC-AUC value ofMiR-21 in diagnosing HCC was 0.910±0.041，which was significantly higher than thatof AFP（0.860±0.037，t=6.3042，P＜0.01）.The specificity ofmiR-21 in detecting HCC was 88.1%，which was remarkably higher than thatof AFP（69%，χ2=4.5253，P=0.033）.Conclusion After TACE the serum MiR-21 level in HCC patients is significantly decreased，which is very helpful in predicting the therapeutic efficacy of TACE.Therefore，MiR-21 can be regarded as apotentialmolecularmarker of HCC.（J Intervent Radiol，2014，23：406-410）

hepatocellular carcinoma；transcatheter arterial chemoembolization；miRNA-21；serum

R735.7

A

1008-794X（2014）-05-0406-05

2013-11-13）

（本文編輯：俞瑞綱）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.05.009

226001江蘇南通南通市第一人民醫院腫瘤科（王以浪、王亞非、張亮、繆亞軍、印滇），介入科（陳卓、周陳、丁文彬）

丁文彬E-mail：oncowang@163.com