既往有償獻血HIV-1感染者中合并感染的HCV對telaprevir和boceprevir天然耐藥分析

鮑毅，田地，鄭穎穎，席宏麗，劉丹，于敏，徐小元

既往有償獻血HIV-1感染者中合并感染的HCV對telaprevir和boceprevir天然耐藥分析

鮑毅，田地，鄭穎穎，席宏麗，劉丹，于敏，徐小元

目的分析既往有償獻血人群HIV-1感染者中合并感染的HCV對telaprevir和boceprevir的天然耐藥，為HCV的耐藥監測及臨床抗病毒治療提供基礎數據。方法收集既往有償獻血人群HIV陽性患者的血漿樣本，檢測其HCV抗體，應用巢式PCR擴增HCV NS3/4A區，對測序結果進行耐藥分析，計算耐藥率，評價耐藥毒株的流行趨勢。結果從150份符合要求的樣本里共獲得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列。檢測出耐藥相關突變4例（5.71%），其中對boceprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點為R117H和A156V；對telaprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點為R117H和A156V；對telaprevir可能耐藥2例（2.86%），耐藥位點為T54S。尚未發現V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已報道的耐藥位點。其他突變中，氨基酸替換率超過90%的變異位點有I35V、A40T、R62K、I64L、V71I、S66G、S91A和T42S；在系統進化樹中，耐藥序列呈點狀散在分布，未發現聚集性。結論既往有償獻血HIV-1感染者中合并感染的HCV對telaprevir和boceprevir存在天然耐藥，耐藥相關突變率分別為5.71%和2.86%。其他氨基酸位點出現突變率較高，但是未發現與耐藥相關。各耐藥菌株之間未發現傳播關聯性。

丙型肝炎病毒；HIV；蛋白酶抑制藥；藥物耐受性；供血者

HIV和HCV有著共同的傳播途徑：血液傳播、性傳播和垂直傳播，因此HIV-1和HCV常發生合并感染[1-2]。在我國，以靜脈注射毒品和輸血為傳播途徑的HIV-1感染者中，合并HCV感染率達85%～97%[3-4]。一般情況下，70%以上的HCV感染可能發展為慢性，其中有10%～20%在感染20年后可發展至肝硬化，1%～5%在感染30年后可發展為肝癌[5]。當合并HIV-1感染時，HIV-1通過對免疫抑制或免疫紊亂的影響引起HCV感染后復制水平升高，肝硬化發病率更高，疾病進展更快[6-7]。可見對合并HCV/ HIV感染者進行有效的抗HCV治療是有必要的。

近年來，HCV的直接抗病毒治療藥物研究進展迅速，針對NS3/4A的蛋白酶抑制劑（boceprevir和telaprevir）已在美國上市，其中美國Vertex公司研制的telaprevir聯合聚乙二醇干擾素（pegylated interferon,Peg-IFN）和利巴韋林治療HCV基因1型感染的病毒學應答率達80%以上，優于Peg-IFN聯合利巴韋林的抗HCV治療[8-9]，其應用前景已寫入2011年最新的歐洲肝臟病學會HCV感染管理指南[10-12]。但HCVNS3區的V36M/A、T54A、R155K/T和A156V/ T變異可引起病毒耐藥[13]，有研究發現在未接受治療的患者中可檢出耐藥位點，而引起天然耐藥[14-15]。目前我國既往有償獻血人群中HIV-1/HCV合并感染者對蛋白酶抑制劑的耐藥情況尚不清楚。

本研究對我國中部地區20世紀90年代中期因有償獻血感染HIV-1者的血液標本中合并感染的HCV進行耐藥檢測，了解其對telaprevir和boceprevir的天然耐藥特征。

1 對象與方法

1.1 對象150份由北京佑安醫院艾滋病中心2005—2007年收集的河南省有償獻血者血漿，均經當地疾病預防控制中心采用Western blot法確證為HIV感染。HCV IgG抗體檢測采用意大利DiaSorin公司生產的HCV抗體酶聯免疫診斷試劑盒。采集血液之前，患者未使用任何抗病毒藥物、干擾素和蛋白酶抑制劑，血樣經乙二胺四乙酸（EDTA）-2k抗凝，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 HCVRNA的提取從每份樣本中取200μl血漿，按照MiniBESTViralRNA/DNAExtraction KitVer. 4.0試劑盒（TaKaRa公司，大連）說明提取HCVRNA。

1.3 巢式PCR基因片段的擴增參照HCV標準株（H77，基因庫編號AF009606）的序列，按巢式PCR法設計合成2對PCR引物，使用PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2擴增HCV NS3/4A區。反應條件如下：第1輪，以HCV NS3F1/HCV NS3R1為外側引物，取2×1 Step Buffer 12.5μl，PrimeScript One Step Enzyme1 1μl，引物各2μl，7.5μlRNA為反應模板，配成25μl的反應體系，進行第1次PCR反應，50℃30min，94℃2min，1個循環；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，35個循環；72℃10min。第2輪，以HCV NS3F2/HCV NS3R2為內側引物，10×Ex緩沖液5μl，10mmol/L 4dNTPmix（final2.5mmol/L）4μl，Ex Taq（5 U/μl）0.3μl，引物各4μl，去離子水27.7μl，取第1輪PCR產物5μl做模板，配成50μl的反應體系，94℃5min，1個循環；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30個循環；72℃10min。具體引物序列見表1。每次實驗前后嚴格清理超凈工作臺、移液器和試驗臺，并用紫外線消毒，嚴格做陰性對照。

1.4 電泳和測序取5μl第2輪PCR產物，用2.0%瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30min。電泳結果與100 bp的Marker比對，鑒定無誤后，PCR產物送到北京諾賽公司測序，引物為HCV NS3seq：5'-CCTATCACGGCACTCCCAACA-3'。

1.5 耐藥性分析擴增產物經測序獲得基因序列，在HCV數據庫（http://hcv.lanl.gov/content/sequence/ HCV/ToolsOutline.htm l）網站下載HCV參考株序列，用MEGA 4.02軟件Align by clustalW比對基因序列，用鄰接法構建系統進化樹。提交HCV耐藥數據庫（http://hcv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php）［Geno2Pheno（hcv）V1.0 table，Max-Planck-Institute Informatik, Saarbrucken,Germany］進行分析，尋找boceprevir/ telaprevir耐藥相關突變。病例樣本檢測結果按抗病毒藥物敏感、潛在耐藥和耐藥進行評估判斷。

表1 HCV NS3/4A區擴增的巢式PCR引物的名稱、序列、位置和長度Table 1 Name,sequence,position and length of HCV NS3/4A area augmentation of nested PCR primers

2 結果

2.1 一般情況150例年齡29～60歲，平均44.7歲；其中男86例，女64例；HCV抗體陽性106例。共成功測序獲得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列，序列長度約790 bp，提交到HCV耐藥數據庫檢測發現基因1b型68例（97.14%），基因2a型2例（2.86%）。

2.2 耐藥位點提交所有序列到HCV耐藥數據庫檢測，發現T54S、A156V、R117H這3個耐藥位點。耐藥樣本4例，具體耐藥位點分別是HNDB2：T54S，HNDB22：A156V，HNDB31：R117H，HNDB34：T54S（圖1）。

2.3 耐藥率分析許多體內和體外研究已發現HCV NS3/4A區的氨基酸替換可導致對蛋白酶抑制劑耐藥，本研究檢測到的耐藥位點有T54S、R117H和A156V，分別占2.86%、1.43%和1.43%。耐藥樣本共4例（5.71%），其中對boceprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點為R117H（1.43%）和A156V（1.43%）；對telaprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點為R117H（1.43%）和A156V（1.43%），對其可能耐藥2例（2.86%），耐藥位點為T54S。未檢測到V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已報道的耐藥位點[13，16-17]（表2）。

圖1 既往有償獻血感染HIV-1人群中HCV NS3/4A區對boceprevir/telaprevir的耐藥位點Figure 1 HCV NS3/4A resistance loci of boceprevir/tela-previr in previous paid blood donorsw ith HIV-1 infection

表2 HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑耐藥突變的分布Table 2 Distribution of HCV NS3/4A protease inhibitor resistancemutations

2.4 其他突變位點除了以上發生耐藥突變的氨基酸位點外，HCV NS3/4A還發生其他的堿基變異導致氨基酸替換。根據H77參考株，本組中替換率最高的為I35V和A40T（均高達100%），其次是R62K、I64L、V71I等，高達97.1%；S66G、S91A和T42S替換率分別是95.7%、92.9%和91.4%。

2.5 HCV NS3/4A序列系統進化樹分析70份基因序列經過系統進化樹分析，HNDB19和HNDB24聚集在參考株2a-JFH-1-AB047639，屬于2a型；其他序列都聚集在參考株1b-AH1-AB429050，屬于1b型，標記的耐藥序列呈點狀散在分布，未發現聚集性。

3 討論

HCV是丙型肝炎的病原體，為黃病毒科，球形顆粒，直徑約50 nm，有包膜。其基因組為單股正鏈的RNA病毒，全長約9.6 kb，含1個開放閱讀框，HCV基因組翻譯成1個聚蛋白前體，可經蛋白酶水解為10個具有多種生物活性的病毒蛋白：Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，這些病毒蛋白在HCV的生活史中發揮著重要的作用[18]。病毒復制時的高自然錯配率（大約每個基因每次復制周期可發生1個核苷酸錯配）及RNA聚合酶的低保真性導致HCV基因極易突變，產生耐藥，成為直接抗病毒治療藥物臨床研究中的主要挑戰[19]。

目前對慢性HCV感染以干擾素加利巴韋林為主要治療手段[20]，但價格昂貴，不良反應較多，因此急需新型抗HCV藥物的出現[8-9]。多種針對HCV的新型藥物如蛋白酶抑制劑和RNA聚合酶抑制劑等已被證明可強效抑制HCV復制，迅速降低血清HCVRNA水平，并縮短療程。Telaprevir和boceprevir現已在美國上市[10-12]。

然而，由于基因變異的影響，在同一患者體內存在一系列HCV的準種群，當進行抗病毒治療時，藥物的選擇壓力可導致耐藥菌株成為優勢株，從而引起繼發耐藥[21]。但如果用藥前耐藥變異株在病毒準種池中已成為相對優勢株，在用藥后能迅速成為絕對優勢株而引起原發耐藥[15，22]，這種情況已在未經治療的慢性丙型肝炎中得到發現。Franco等[14]采用Allelespecific PCR檢測45例未治療的HCV基因1b型感染者的天然耐藥，檢測到A156T 23例（51%），A156V 13例（29%），A156S1例（2%）和V36A 12例（27%）等耐藥突變。Bartels等[17]研究發現570例未治療的HCV感染者體內的HCV存在耐藥變異，產生耐藥位點分別是V36M（0.9%）、R155K（0.7%）、V170A（0.2%）和R109K（0.2%）。Vicenti等[15]對67例基因1a亞型和42例基因1b亞型未接受蛋白酶抑制劑治療的意大利HCV感染者測序發現，至少有1個突變位點的有21例（19.3%），10例檢測到與boceprevir和telaprevir耐藥相關突變（9.2%），耐藥位點是V36L、T54S和V55A，其中1例同時檢測到V36L和T54S突變。

本研究檢測到T54S（2.86%）、A156V（1.43%）和R117H（1.43%）3個耐藥位點，耐藥樣本4例（5.71%）。R117H/A156V單獨突變都能引起telaprevir和boceprevir耐藥，T54S單獨突變只能引起telaprevir的可能耐藥，不能引起boceprevir耐藥。尚未發現V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/ E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已報道的耐藥位點[14-15]。本實驗陽性率較低，可能的原因是標本存放較久。所有樣本雖然未使用蛋白酶抑制劑，但仍然檢測到了部分國外已經報道的耐藥位點，提示我國HCV感染者天然存在對telaprevir和boceprevir耐藥。根據H77參考株，檢測到HCV NS3/4A基因序列還發生其他的堿基變異導致氨基酸替換，部分堿基的替換可能會引起反轉錄酶或蛋白酶分子的空間構型發生改變，致使病毒對治療藥物的敏感性降低，導致HCV耐藥性的出現[22]。在抗病毒治療過程中，藥物選擇壓力可使耐藥病毒株迅速成為患者體內主要病毒株，導致耐藥發生[22]。基因序列經過進化樹分析，提示河南省既往有償獻血HIV-1感染者中合并感染的HCV基因型以1b型為主，耐藥序列呈點狀散在分布，未發現聚集性。可能的原因為該省有償獻血HIV-1感染者中合并HCV感染的時間較久，耐藥位點在感染者體內自發突變，而非來自不同患者間的傳播。

總之，既往有償獻血感染HIV-1人群中合并感染的HCV對telaprevir和boceprevir存在天然耐藥，但耐藥水平處在較低狀態。抗HCV藥物在提高持續病毒學應答率、縮短療程、提高耐受性和降低耐藥危險性方面還有很長的路。

志謝非常感謝北京佑安醫院吳昊教授和夏煒老師的熱心幫助

[1]Joshi D,O'Grady J,Dieterich D,et al.Increasing burden of liver disease in patients with HIV infection［J］.The Lancet,2011,377 (9772):1198-1209.

[2]田地，李林，李天一，等.河南省有償供血人群HIV/HCV混合感染者HIV-1細胞嗜性的研究［J］.傳染病信息，2011，24(6):334-338.

[3]Liao L,Xing H,Su B,etal.Impact of HIV drug resistance on virologic and immunologic failure and mortality in a cohortof patients on antiretroviral therapy in China［J］.AIDS,2013,27(11):1815-1824.

[4]Tian D,Li L,Liu Y,etal.Different HCV genotype distributions of HIV-infected individuals in Henan and Guangxi,China［J］.PloS one,2012,7(11):e50343-11.

[5]Fierer DS,Dieterich DT,Fiel MI,et al.Rapid progression to decompensated cirrhosis,liver transplant,and death in HIV-infected menafterprimaryhepatitisCvirusinfection［J］.Clin InfectDis,2013, 56(7):1038-1043.

[6]Merchante N,Merino E,Rodríguez-Arrondo F,etal.HIV/hepatitis C virus-coinfected patients who achieved sustained virological response are still at risk of developing hepatocellular carcinoma［J］. AIDS,2014,28(1):41-47.

[7]Linas BP,Barter DM,Leff JA,et al.The cost-effectiveness of improved hepatitis C virus therapies in HIV/hepatitis C virus coinfected patients［J］.AIDS,2014,28(3):365-376.

[8]Kowdley KV,Lawitz E,Poordad F,etal.Phase 2b trial of interferon-free therapy for hepatitisC virusgenotype1［J］.NEngl JMed, 2014,370(3):222-232.

[9]Tanaka Y,Nishida N,Sugiyama M,et al.Genome-wide association of IL28Bwith response topegylated interferon-alphaand ribavirin therapy for chronic hepatitis C［J］.Nat Genet,2009,41(10):1105-1109.

[10]Jacobson IM,McHutchison JG,Dusheiko G,et al.Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C virus infection［J］.N Engl JMed,2011,364(25):2405-2416.

[11]Ghany MG,Nelson DR,Strader DB,etal.An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection:2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases［J］.Hepatology,2011,54(4):1433-1444.

[12]饒慧瑛，魏來.慢性丙型肝炎直接抗病毒藥物的研究進展和應用前景［J］.傳染病信息，2012，25(2):83-86.

[13]Nishiya AS,de Almeida-Neto C,Ferreira SC,et al.HCV genotypes,characterization of mutations conferring drug resistance to protease inhibitors,and risk factors among blood donors in S?o Paulo,Brazil［J］.PloSone,2014,9(1):e86413-9.

[14]Franco S,Bellido R,Aparicio E,etal.Natural prevalence of HCV minority variants that are highly resistant to NS3/4A protease inhibitors［J］.JViral Hepat,2011,18(10):e578-e582.

[15]Vicenti I,Rosi A,Saladini F,etal.Naturally occurring hepatitis C virus(HCV)NS3/4A protease inhibitor resistance-related mutations in HCV genotype1-infected subjectsin Italy［J］.JAntimicrob Chemother,2012,67(4):984-987.

[16]Shimakami T,Welsch C,Yamane D,et al.Protease inhibitor-resistant hepatitis C virus mutants with reduced fitness from impaired production of infectious virus［J］.Gastroenterology,2011, 140(2):667-675.

[17]Bartels D J,Sullivan JC,Zhang EZ,etal.Hepatitis C virus variants with decreased sensitivity to direct-acting antivirals(DAAs) were rarely observed in DAA-naive patients prior to treatment［J］. JVirol,2013,87(3):1544-1553.

[18]Moradpour D,Penin F,Rice CM.Replication of hepatitis C virus［J］.Nat Rev Microbiol,2007,5(6):453-463.

[19]Hiraga N,Imamura M,Abe H,etal.Rapid emergence of telaprevir resistant hepatitis C virus strain from wildtype clone in vivo［J］. Hepatology,2011,54(3):781-788.

[20]鄭穎穎，范曉紅，王力芬，等.聚乙二醇干擾素α-2a聯合利巴韋林治療老年慢性丙型肝炎的療效和安全性［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27(8):821-823.

[21]Law M,Maruyama T,Lewis J,et al.Broadly neutralizing antibodies protect against hepatitis C virus quasispecies challenge［J］.Nat Med,2008,14(1):25-27.

[22]Powdrill MH,Tchesnokov EP,Kozak RA,et al.Contribution of a mutational bias in hepatitis C virus replication to the genetic barrier in the development of drug resistance［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(51):20509-20513.

（2014-01-21收稿 2014-03-28修回）

（責任編委 張玲霞 本文編輯 陳玉琪）

Naturally occurring HCV resistance to telaprevir and boceprevir in previous paid blood donorsw ith HCV/HIV-1 co-infection

BAO Yi,TIAN Di,ZHENG Ying-ying,XIHong-li,LIU Dan,YU Min,XU Xiao-yuan*
Department of Infectious Diseases,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China
*Corresponding author,E-mail:yangpin@public3.bta.net.cn

Objective To analyze naturally occurring HCV resistance to telaprevir and boceprevir in previous paid blood donorswith HCV/HIV-1 co-infection,and provide basic data fordrugmonitoring and antiviral therapy for HCV.M ethods Plasma samples were collected from previous paid blood donors with HIV-1 infection,and HCV antibodies were detected.The HCV NS3/4A region was amplified using nested PCR,and drug resistance analysis was made by calculating resistance rate and assessing the prevalence of resistant strains.Results A total of 70(46.67%)fragments containing HCV NS3/4A region were successfully amplified from 150 samples.Drug resistance-related mutations were detected in 4(5.71%)patients,resistance to boceprevir in 2 patients (2.86%),with the resistance lociof R117H and A156V,and resistance to telaprevir in 2(2.86%)patients,with the resistance loci of R117H and A156V;possible resistance to telaprevir was found in 2(2.86%)patients,with the resistance locus of T54S.Previously reported resistance loci,such as V36A/M/L/C,Q41H/R,F43C/S,T54A,V55A,Q80R,R109K,S138C,R155G/I/K/M/T/Q/S,A156S/ T,D168A/E/G/H,V170A/T/I,N174G/S and L175M,were not detected.I35V,A40T,R62K,I64L,V71I,S66G,S91A and T42S exhibited a high replacement rate of over 90%.Phylogenetic analysis showed that drug resistance lociwere scatteredly distributed in the phylogeny tree,and no aggregation was detected.Conclusions HCV resistance to telaprevir and boceprevir occurs naturally in previous paid blood donorswith HCV/HIV-1 co-infection,with the resistance rates of 5.71%and 2.86%,respectively.Other loci exhibit highmutation rates,but no correlation with drug resistance is found.Moreover,no correlation is found among the resistant strains.

HCV;HIV;protease inhibitors;drug tolerance;blood donors

R373.21；R373.51

A

1007-8134(2014)03-0160-04

國家“十二五”科技重大專項（2012ZX10002003-004-003）；北京市科委2012年度科技計劃重大項目（D121100003912-003）

100034，北京大學第一醫院感染疾病科（鮑毅、田地、鄭穎穎、席宏麗、劉丹、于敏、徐小元）

徐小元，E-mail:yangpin@public3.bta.net.cn