MALDI-TOF-MS鑒定宋內志賀菌的臨床應用

鮑春梅，宋新愛，崔恩博，王歡，張鞠玲，陳素明，張成龍，賈天野，曲芬，毛遠麗

MALDI-TOF-MS鑒定宋內志賀菌的臨床應用

鮑春梅，宋新愛，崔恩博，王歡，張鞠玲，陳素明，張成龍，賈天野，曲芬，毛遠麗

目的建立基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）鑒定宋內志賀菌的質譜數據庫，實現對臨床分離宋內志賀菌的快速鑒定。方法建立經提取法處理后鑒定宋內志賀菌的質譜數據庫。在分別使用直接涂抹法和提取法處理后對200株宋內志賀菌野生株進行鑒定驗證；同時針對宋內志賀菌的不同菌相、不同激光強度和不同樣本保存時間分別進行MALDI-TOF-MS鑒定。再選取100株大腸埃希菌，進行MALDI-TOF-MS鑒定，以確定新建數據庫的特異性。結果宋內志賀菌經提取法處理后的鑒定符合率為100%，經直接涂抹法處理后的鑒定符合率為71.5%。宋內志賀菌不同菌相和不同激光強度的鑒定結果差異無統計學意義（P＞0.05）；而樣本不同保存時間鑒定結果差異有統計學意義（P＜0.05）。使用新數據庫后，大腸埃希菌鑒定符合率為96.0%。結論經提取法處理后應用MALDI-TOF-MS鑒定宋內志賀菌建立的質譜數據庫，能快速、準確鑒定宋內志賀菌到種水平，滿足腹瀉病原菌臨床分離株的快速診斷。

志賀菌屬；提取法；微生物學；圖譜

宋內志賀菌屬于志賀菌D群，是引起胃腸道感染的主要病原菌之一，老人、兒童和免疫功能受損的患者多發。發達國家流行的主要是宋內志賀菌，而發展中國家雖然長期以來流行的為福氏志賀菌，但近年來宋內志賀菌呈明顯增加的趨勢，并成為優勢菌群[1]。目前，大多數實驗室鑒定宋內志賀菌的方法主要通過生化代謝反應和血清凝集試驗來完成，一般都需要16～18 h。細菌基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization-time of flightmass spectrometry,MALDITOF-MS）技術是近年來發展起來的一種新型的軟電離技術，主要通過分析細菌的核糖體蛋白對細菌進行鑒定，具有速度快、通量高、鑒定準、范圍廣的特點。在很多歐洲國家質譜儀已成功運用于臨床微生物學實驗室的診斷，此外它在防恐事件、食品安全和環境監測的應用也很廣泛[2]。但是，大腸埃希菌和宋內志賀菌親緣關系的相近性，使質譜儀在鑒定志賀菌上有一定的局限性。如果能實現MALDITOF-MS對宋內志賀菌的準確鑒定，傳統鑒定時間可以從16～18 h縮短為3～5min。現將我們的研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株24株建庫的宋內志賀菌為VITEKⅡ鑒定、生化反應和血清凝集試驗及16SrRNA確認的臨床株，200例宋內志賀菌驗證株為臨床分離株。

1.1.2 培養基和試劑MH培養基購自北京天壇生物制品有限公司，宋內志賀菌診斷血清（批號20120501）購自寧波天潤生物制品有限公司，進行質譜分析所需試劑包括甲酸（批號100331）、乙腈（批號106245）、三氟乙酸（批號104536）和無水乙醇（批號086987），均由美國Fisher公司提供的色譜純，BTS標準品、基質α-氰基-4-對羥基肉桂酸（批號165252）和MSP96孔靶由德國Bruker公司提供。PCR擴增試劑盒購自大連寶生物TaKaRa公司。

1.1.3 儀器MALDI-TOF-MS儀器由德國Bruker公司提供。VITEKⅡ全自動微生物鑒定儀由法國梅里埃公司提供。

1.2 方法

1.2.1 宋內志賀菌的建庫

1.2.1.1 分純選取24株建庫的宋內志賀菌，在MH培養基上分純后待用。

1.2.1.2 基質和BTS標準品配制在基質和BTS標準品中分別加入200μl和100μl的標準溶液，超聲震蕩混勻，于-20℃保存備用。標準溶液為50%乙腈、2.5%三氟乙酸和47.5%超純水的混合溶液。

1.2.1.3 固定滅活在1.5ml的Eppendorf微型離心管中加入300μl純凈水，用無菌牙簽挑取5mg菌落樣品加入Eppendorf微型離心管中，仔細混勻后再加入900μl無水乙醇，再次混勻后高速離心2 min，棄去上清。

1.2.1.4 蛋白溶出在棄去上清的Eppendorf微型離心管中加入50μl70%甲酸，仔細混勻后再加入50μl純乙腈，再次混勻后高速離心2min，吸取上清點靶。

1.2.1.5 點靶先點1μl上清，放干后再點1μl基質。每個相同的菌液在靶位上排列4個點，BTS標準品1μl放在96孔靶的任一位置，放干后再點1μl基質，待干燥后上機。

1.2.1.6 采集數據放入已點好樣品和校準品的靶板。打開FlexControl軟件，校準儀器，選擇數據采集方法，調好儀器參數，采用氮基光源、線性陽離子檢測模式，延遲時間為130 ns，激光強度為40%，每個樣本設激光隨機射擊100個點，每次射擊5次，采集范圍為2000～20 000 Da。用鼠標點擊“開始”按鈕，采集標準品的數據進行儀器校準。然后編輯自動采集方法“AutoXecute Method”，用鼠標點擊“開始”按鈕，采集宋內志賀菌的樣品數據，每個菌株采集20張譜圖并保存。

1.2.1.7 建立數據庫將采集好的24株宋內志賀菌的480張譜圖數據打開后，點擊“createMSP”，將譜圖調入D:dateshd的根目錄下，完成數據庫的建立。

1.2.2 宋內志賀菌經2種不同處理方法后的質譜儀鑒定

1.2.2.1 直接涂抹法點靶經VITEKⅡ全自動微生物鑒定儀和血清凝集試驗確認后的200株宋內志賀菌臨床野生株培養、分純后，用無菌牙簽取單個菌落直接涂抹于靶板上，放干后在每個載有標本的靶位上點上基質，待干燥后上機鑒定。標準品點在靶位的任一位置。

1.2.2.2 提取法點靶取上述200株宋內志賀菌臨床野生株參照1.2.1.3～1.2.1.4所述宋內志賀菌建庫時的步驟處理后，每株菌先點1μl上清液于靶板上，放干后再點1μl基質，待干燥后上機鑒定。標準品點在靶位的任一位置。

1.2.2.3 采集數據同1.2.1.6，每個菌株累計500個點，保存譜圖。

1.2.2.4 數據分析采集數據后，使用Biotyper原有數據庫以及新建宋內志賀菌數據庫聯合進行分析鑒定。

1.2.2.5 結果判斷細菌菌屬及種判斷標準如下：2.300～3.000分，完全可靠地鑒定到種的水平；2.000～2.299分，可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平；1.700～1.999分，有可能鑒定到屬的水平；0.000～1.699分，沒有可信的鑒定結果。

1.2.3 宋內志賀菌不同菌相的質譜儀鑒定分別取23株宋內志賀菌的Ⅰ相和Ⅱ相，使用提取法進行鑒定。宋內志賀菌Ⅰ相為光滑型菌落，Ⅱ相為粗糙型菌落，Ⅰ相和Ⅱ相分別用宋內志賀菌血清凝集試驗確認。

1.2.4 設置不同激光強度的質譜儀鑒定設置不同儀器參數，激光強度分別設置為40%和50%，使用提取法進行宋內志賀菌鑒定。

1.2.5 樣本不同保存時間的質譜儀鑒定選取90株宋內志賀菌在提取法固定滅活后，分別采用立即點靶上機和固定滅活后樣本放置4℃冰箱冷藏10 d后上機鑒定。

1.2.6 宋內志賀菌質譜數據庫的特異性驗證選取100株經生化反應和VITEKⅡ鑒定確認的大腸埃希菌，使用Biotyper原有數據庫以及新建宋內志賀菌數據庫進行分析鑒定。

1.3 統計學處理采用SPSS 2004軟件進行統計分析，2組計量資料呈正態分布，且方差齊，組間比較用配對t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宋內志賀菌經不同處理方法后的質譜儀鑒定結果2種不同的菌株前處理方法的鑒定結果不同。采用直接涂抹法后質譜儀準確鑒定宋內志賀菌200株，其中143株鑒定分值全部在2.300～3.000分，完全準確地鑒定到種的水平，57株被錯誤地鑒定為大腸埃希菌，鑒定準確率為71.5%（143/200）；而采用提取法后質譜儀準確鑒定200株，200株宋內志賀菌鑒定分值全部在2.300～3.000分，完全可靠地鑒定到種的水平，鑒定準確率為100%（200/200）。2.2宋內志賀菌和大腸埃希菌的質譜峰圖比對2種菌在不同分子量的蛋白峰差異較小，通過比對分析發現大腸埃希菌的特異峰為1個，分子量約為2837Da；宋內志賀菌的特異峰為4個，分子量分別約為3247、4164、4873、5613Da（圖1、表1）。

圖1 大腸埃希菌和宋內志賀菌的蛋白質圖譜Figure 1 Protein spectrum of Escherichia coli and Shigella sonnei

表1 大腸埃希菌和宋內志賀菌主要蛋白峰信息表Table 1 M ain protein peak information of Escherichia Coli and Shigella sonnei

2.3 宋內志賀菌不同菌相的質譜儀鑒定結果Ⅰ相與Ⅱ相鑒定分值差異無統計學意義（t=1.101，P= 0.283）。

2.4 不同激光強度的質譜儀鑒定結果2種激光強度鑒定分值差異無統計學意義（t=0.341，P= 0.735）。

2.5 不同保存時間的質譜儀鑒定結果90株宋內志賀菌在提取法固定滅活后，分別采用立即點靶上機和樣本保存10 d上機鑒定。直接點靶上機的鑒定分值為（2.65±0.05）分；樣本保存10 d后上機的鑒定分值為（2.67±0.06）分，2個保存時間點樣本鑒定分值差異有統計學意義（t=2.029，P=0.045）。

2.6 宋內志賀菌質譜數據庫的特異性驗證使用Biotyper原有數據庫對100株大腸埃希菌進行分析鑒定，鑒定準確率為100%。如果使用Biotyper原有數據庫以及新建宋內志賀菌數據庫聯合進行分析鑒定，96株被準確鑒定為大腸埃希菌，鑒定準確率為96.0%（96/100）。

3 討論

宋內志賀菌是引起細菌性腹瀉的重要病原菌，它引起的腹瀉感染一般病情較輕，具有隱匿性，而它在各群志賀菌中抵抗力最強，可能是其感染增加的原因之一。目前，在國內實驗室使用的經典方法為全自動微生物鑒定/藥敏分析系統或API條、克氏雙糖鐵以及診斷血清，進行宋內志賀菌的鑒定和凝集試驗，這些方法主要依賴細菌的生化代謝反應和血清凝集來判定結果，耗時較長。MALDI-TOFMS是一種鑒定微生物的高通量方法[3-4]，它不僅可以用于臨床微生物實驗室的常規診斷，還可應用于環境學、分類學及食品加工的質量控制。它擁有Biotyper廣泛數據庫的質譜技術，鑒定范圍包括常見臨床致病細菌（需氧菌、厭氧菌、苛養菌等）、真菌（酵母菌、絲狀真菌等）以及一些高致病性菌（土拉熱弗朗西斯菌、布魯菌、炭疽桿菌等）以及疑難菌種（奴卡氏菌、放線菌等），目前可鑒定菌種目錄已達4638種，這對于臨床感染性疾病的治療和轉歸起著重要的作用。研究發現質譜儀在鑒定細菌屬的符合率可達到95.0%和98.8%，種的符合率也可達到92.0%和83.8%，是一種準確、高效的細菌鑒定方法，它甚至不需要單克隆菌落，可利用體液標本（血液和尿液）培養直接進行細菌鑒定，大大節省了臨床報告時間[5-7]。但我們也從研究中看到了質譜儀的一些不足，比如大多數學者提出質譜儀對肺炎鏈球菌和志賀菌的鑒定準確率低的問題。宋內志賀菌與大腸埃希菌種族關系相近，它在Biotyper數據庫中被認為是大腸埃希菌種系的一部分，其數據庫中并沒有宋內志賀菌的鑒定譜圖，這無疑給使用MALDITOF-MS鑒定腹瀉病原菌造成了困難。He等[8]使用Biotyper原有數據庫未能成功鑒定宋內志賀菌，也無法將出血性大腸埃希菌與非致瀉性大腸埃希菌正確區分，而Schaumann等[9]則通過自建庫的方式，使用“support-vector-machines”聚類方法成功鑒定宋內志賀菌以及鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。

我們的實驗研究建立了宋內志賀菌質譜數據庫，發現宋內志賀菌蛋白峰與大腸埃希菌的大部分蛋白峰相似，這也是2個菌屬無法區分的主要原因。通過比對分析發現了大腸埃希菌和宋內志賀菌的特異峰，這些峰值代表著不同的生物分子蛋白，包括細菌內部和表面的蛋白，這些獨特蛋白峰可以區分細菌的屬、種和亞種。

本研究對200株宋內志賀菌臨床野生株進行質譜儀鑒定，宋內志賀菌經涂抹法驗證鑒定準確率為71.5%，而經提取法鑒定準確率為100%。這與我們先前的50例宋內志賀菌的小樣本量研究結果相似[10]，這一結果提示質譜儀鑒定前樣本的處理應標準化。直接涂抹法雖操作簡便，可重復性好，但相對而言，其質譜峰的質量易受涂抹均勻性、雜質（如脂質和多糖）峰等背景峰干擾，造成信噪比降低，直接影響鑒定結果的準確性。提取法能有效提取細菌表面蛋白，降低背景峰干擾，信噪比良好，是值得被推薦使用的處理方法[11]。國外也有文獻報道，對于疑難菌的鑒定，提取法可以得到更高的蛋白濃度及高質量的質譜圖，并且不會受到另外樣本儲存的影響[12]。此外，前處理法鑒定率高也可能與建庫時所選用的前處理法的一致性有關。直接涂抹法中鑒定錯誤的菌株均被誤判為大腸埃希菌，因為志賀菌和大腸埃希菌具有相同的抗原成分，在血清凝集試驗中也會有交叉凝集的現象發生。

宋內志賀菌Ⅰ相呈光滑型菌落，多自急性期感染患者標本中分離獲得。Ⅱ相為粗糙型菌落，常從慢性患者或帶菌者標本中檢出。宋內志賀菌的生物學特性為較屬內其他菌種易發生變異，最常見的變異是位相變異，即Ⅰ相轉變成Ⅱ相菌。有文獻報道，宋內志賀菌從Ⅰ相轉變為Ⅱ相是因為丟失了遺傳物質的基因片段，Ⅱ相缺乏的是分子量在120～180MDa的大質粒。通常有毒力的宋內志賀菌Ⅰ相包含了5600、6800、110 000～117 000和170 000～237 000的堿基對[13-14]。本實驗中宋內志賀菌不同相位的質譜儀鑒定結果差異無統計學意義，可能與宋內志賀菌Ⅱ相丟失的遺傳物質不在質譜儀分析的核糖體蛋白中有關，也提示目前尚不能用質譜儀區分菌相。

此外，質譜儀對細菌的鑒定還會受到很多因素的影響，比如基質的選擇、培養基的選擇、樣品保存時間長短、儀器參數的設置（自動或手動模式、激光強度、分子量檢測范圍）等。本實驗中通過設置不同的激光強度對宋內志賀菌進行鑒定，在鑒定分值上并沒有發現差異，說明一定范圍內激光強度的改變對采集的譜圖的影響可忽略，40%～50%的激光范圍均適用于宋內志賀菌的鑒定。Pasella等[15]研究顯示蛋白樣本在短期（13 d）儲存中，4℃儲存條件與-80℃、-20℃和室溫（20～25℃）相比較，降解過程更容易受到影響。本實驗對于固定滅活后的樣本的穩定性進行研究，樣本于-20℃保存10 d后質譜儀鑒定的分值高于直接上機鑒定的分值，差異有統計學意義，說明固定滅活后的宋內志賀菌樣本在-20℃的貯存環境下的穩定性很好，這與Bruker公司提供的操作說明一致，酒精固定滅活后的樣本在2周之內儲存于-20℃，都可以進行質譜儀鑒定，并不會影響鑒定結果。Martiny等[16]報道，使用Microflex LT的Biotyper數據庫不能區分志賀菌和大腸埃希菌，所有的志賀菌都被誤判為大腸埃希菌。我們建立宋內志賀菌新數據庫后，為了防止大腸埃希菌被誤判為宋內志賀菌，隨機選取生化反應符合大腸埃希菌的100例臨床分離株，使用新建宋內志賀菌數據庫以及原有的Biotyper數據庫進行鑒定，大腸埃希菌的鑒定準確率為96.0%。實驗結果顯示，質譜儀對大腸埃希菌的鑒定準確率比單獨使用Biotyper數據庫有所下降，提示在使用質譜儀鑒定時，對于不能確定是大腸埃希菌還是志賀菌的疑難菌株，特別是來自腹瀉患者的分離株，還可以使用血清凝集輔助診斷，以免發生誤診。

MALDI-TOF-MS有關宋內志賀菌數據庫成功建立后，可以通過自建庫的方式不斷擴充Biotyper數據庫的菌種，提高質譜儀的鑒定能力，擴大鑒定范圍。MALDI-TOF-MS技術不但縮短了鑒定時間，也使傳統的繁瑣鑒定流程得以改善，為臨床腹瀉病原菌的快速診斷提供了有力的手段，實現了早發現、早治療，能更好地服務于臨床。

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（2014-03-28收稿 2014-05-08修回）

（責任編委 張玲霞 本文編輯 王 姝）

Clinical application ofmatrix-assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry for the identification of Shigella sonnei

BAO Chun-mei,SONG Xin-ai,CUIEn-bo,WANG Huan,ZHANG Ju-ling, CHEN Su-ming,ZHANG Cheng-long,JIA Tian-ye,QU Fen*,MAO Yuan-li*
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author.QU Fen,E-mail:qf302@163.com;MAO Yuan-li,E-mail:maoyuanlee@gmail.com

objective To construct a database of Shigella sonnei isolates identified bymatrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF-MS)in order to achieve rapid identification of clinically isolated Shigella sonnei.M ethods A mass spectrometry database of Shigella sonnei isolates identified following extraction method was constructed.A total of 200 wildtype Shigella sonnei strains were identified following direct-smearmethod and extraction method,respectively.Meanwhile,the identification by MALDI-TOF-MSwas conducted for different phases of Shigella sonnei strains,at different laser intensity of the instrument and at different sample storage time.Then,100 Escherichia Coli strains were identified to verify the specificity of the newlyconstructed database.Results Concordance rates were 100%for the identification following extraction method,and 71.5%for the identification following direct-smearmethod.The results of the identification for different phases of Shigella sonnei strains and at different laser intensity of the instrumentwere not significantly different(P＞0.05),and the results of the identification at different sample storage time were significantly different(P＜0.05).Identification concordance rate of Escherichia Coli were 96.0%based on the newly-constructed database.Conclusions Based on the database of Shigella sonnei isolates identified by MALDI-TOF-MS following extraction method,a rapid and correct identification of Shigella sonnei to the species level is obtained,and a rapid diagnosis of the clinical strains of the diarrheal pathogenic bacteria is realized.

Shigella;extraction;microbiology;pictorialworks

R378.25

A

1007-8134(2014)03-0152-05

解放軍第三○二醫院院內課題（YNKT2012030）

100039北京，解放軍第三○二醫院臨床檢驗醫學中心（鮑春梅、宋新愛、崔恩博、王歡、張鞠玲、陳素明、張成龍、賈天野、曲芬、毛遠麗）

曲芬，E-mail:qf302@163.com；毛遠麗，E-mail:maoyuanlee@gmail.com