Br uke r B iotype r和Vitek MS系統質譜分析鑒定革蘭陰性菌臨床分離株的比較研究

王璐，楊柳，任微，褚美玲，孟冬婭，薛文成

Br uke r B iotype r和Vitek MS系統質譜分析鑒定革蘭陰性菌臨床分離株的比較研究

王璐，楊柳，任微，褚美玲，孟冬婭，薛文成

目的比較并評價兩種基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）系統——Bruker MALDIBiotyper系統（以下簡稱Bruker Biotyper系統）和MALDITOFVitek MS系統（以下簡稱Vitek MS系統）在革蘭陰性菌臨床分離株鑒定中的應用。方法收集沈陽軍區總醫院2012年3月—2013年1月分離自血液、尿液、腦脊液、分泌物、傷口拭子和痰液臨床標本的革蘭陰性菌共120株。應用Vitek 2Compact生化鑒定系統將每株細菌鑒定到種，而后采用Bruker Biotyper和Vitek MS系統對其進行鑒定，三者鑒定結果存在差異的菌株經16S rDNA測序最終確認菌種。結果對于120株革蘭陰性菌臨床分離株，Bruker Biotyper和Vitek MS系統在屬的水平上正確鑒定率分別為95.0%和92.5%，在種的水平上正確鑒定率分別為89.2%和86.7%，差異均無統計學意義。結論Bruker Biotyper和Vitek MS系統對革蘭陰性菌臨床分離株的正確鑒定率不存在差異，兩種系統的鑒定結果與各自的圖譜數據庫有密切關系。

光譜法，質量，基質輔助激光解吸電離基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；圖譜；革蘭陰性菌

目前，中國大多數臨床實驗室的細菌鑒定主要依靠常規生化反應鑒定和表型鑒定，包括傳統手工法和自動化儀器鑒定系統。傳統的鑒定方法既繁瑣又費時，從細菌分離培養到鑒定結果報告，至少需要48～72 h，自動化儀器鑒定提高了檢測效率，但通常也需要18～24 h發出報告。與其相比，分子學鑒定方法（如熒光雜交和PCR法）快速、準確，但成本昂貴而且耗力，并不適合于常規大量樣本的鑒定。臨床醫師急需病原微生物的鑒定結果以明確感染源并進行下一步治療，因此，微生物實驗室開展一種簡單快速、準確高效的微生物鑒定方法已成為大家關注的焦點。

本研究分別應用德國Bruker Daltonics公司和法國bioMérieux公司的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laserdesorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）對分離自臨床標本的120株革蘭陰性菌進行鑒定，對檢測結果存在差異的菌株經16S rDNA測序進行確認，并對兩種質譜鑒定系統的檢測結果進行比較和評估。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集沈陽軍區總醫院2012年3月—2013年4月革蘭陰性菌臨床分離株120株（代表40個菌屬和81個菌種）。菌株來源：血液40株、痰液38株、尿液23株、分泌物10株、膿汁2株、腦脊液4株、糞便2株和傷口拭子1株。

1.2 主要儀器及試劑主要儀器及試劑包括BrukerMALDIBiotyper系統（Bruker Daltonics公司，德國）（以下簡稱Bruker Biotyper系統）、MALDI-TOFVitek MS系統（bioMérieux公司，法國）（以下簡稱Vitek MS系統）、Vitek 2 Compact自動鑒定儀（bioMérieux公司，法國）、GN、NH和ANC細菌鑒定卡（bioMérieux公司，法國）、基因組DNA小量提取試劑盒及PCR反應相關試劑（大連寶生物公司）以及Roche480Ⅱ實時熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士）。

1.3 細菌分離培養所有菌株標本均接種在合適的培養基上（5%羊血瓊脂或巧克力培養基），于35℃孵育箱恒溫培養18～24 h（生長條件有特殊要求的菌株置于5%～10%CO2培養箱或厭氧袋中）。每天觀察平板生長狀況及菌落形態，18～24 h后對菌落進行次代純培養。

1.4 Vitek 2Compact生化鑒定對純培養菌株進行革蘭染色，嚴格按照Vitek 2 Compact系統操作程序及GN、NH和ANC細菌鑒定卡說明書進行操作。首先挑取純培養菌落，用0.45%無菌氯化鈉溶液配置成相應濁度的菌懸液，然后應用相應卡片上機鑒定。

1.5 MALDI-TOF-MS系統鑒定

1.5.1 點樣用無菌接種環挑取適量（3～5個）純培養單個菌落涂在質譜儀樣品檢測板上，迅速點樣0.5μl的甲酸覆蓋加樣的位置，隨后再點樣1μlα-氰基-4-羥基肉桂酸溶液覆蓋。室溫放置，待基質液干燥后，將檢測板放入質譜儀檢測。將質控菌株大腸埃希菌ATCC8739作為每一組的校準靶點。

1.5.2 Bruker Biotyper系統結果判讀先通過MALDI-TOF-MS采集多肽和蛋白質的譜峰，再按質量大小排序形成特征的峰譜，即指紋圖，通過每種細菌獨特的蛋白組成來鑒定細菌，應用于不同菌株的鑒定與區分。以線性正性模式用最大頻率（20～200Hz）采集相對分子質量2～20 kDa的圖譜，用Biotyper軟件對所采集的譜圖進行分析。當Bruker Biotyper系統分值≥1.7時，認為結果高度可信。

1.5.3 Vitek MS系統結果判讀先通過MALDITOF-MS獲得譜圖，然后與Vitek MS數據庫中不同微生物家族的種/屬特定譜圖相比對，從而得出鑒定結果。數據庫包含大量臨床相關細菌菌種，運用專用計算方法增加細菌鑒定的準確率。系統以線性正性模式用50 Hz頻率采集相對分子質量2～20 kDa的圖譜，并采用先進的ASC運算法對所得譜圖進行分析。根據所得譜圖與數據庫參考譜圖匹配程度，BioTyper軟件匹配模式可得到0～100的分值（對數值1～3），Vitek MS系統可得到0%～99.9%的數值，當Vitek MS系統分值≥70%時，認為結果高度可信。

1.6 16S rDNA檢測及測序細菌DNA提取采用大連寶生物有限公司DNA提取試劑盒（MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction KitⅡ），嚴格按照說明書要求進行提取。16S rDNA基因擴增嚴格按照試劑盒（TakaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit）說明書進行。PCR基因測序由大連寶生物有限公司測序部完成；測序后序列在GenBank數據庫中進行在線比對。

1.7 鑒定結果判讀當Bruker Biotyper、Vitek MS和Vitek 2Compact系統三者鑒定結果一致時，將此鑒定結果作為最終確認菌種結果；當三者鑒定結果有任何不一致，以16S rDNA基因測序結果為確認結果。根據參考菌株和系統分值，將質譜鑒定結果分類如下：①正確鑒定到種，即質譜鑒定結果與參考菌株在種的水平上完全一致；②正確鑒定到屬，即質譜鑒定結果與參考菌株在屬的水平上一致；③錯誤鑒定，即質譜鑒定結果與最終確認菌株在屬的水平上不一致；④無法鑒定，當Bruker Biotyper系統鑒定分值＜1.7，VitekMS系統鑒定分值＜70%。

1.8 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，2組間計數資料比較用四格表χ2檢驗或連續性校正χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 120株革蘭陰性菌臨床分離株鑒定結果對于本研究中的120株革蘭陰性菌臨床分離株，Bruker Biotyper和Vitek MS系統在屬的水平上正確鑒定率分別為95.0%（114株）和92.5%（111株），差異無統計學意義（χ2=0.640，P=0.424）；二者在種的水平上正確鑒定率分別為89.2%（107株）和86.7%（104株），差異無統計學意義（χ2=0.353，P=0.552）。見表1。

2.2 Bruker Biotyper或Vitek MS系統錯誤鑒定或未鑒定出結果的菌株Bruker Biotyper和Vitek MS系統的鑒定結果與16S rDNA測序結果不符合率分別為5.0%（6株）和7.5%（9株）。Bruker Biotyper系統未鑒定出結果的菌株共有5株，包括銅綠假單胞菌1株，腦膜敗血性黃桿菌1株，普城沙雷菌1株，皮氏羅爾斯頓菌1株和衣氏放線菌1株，此外，Bruker Biotyper系統將1株水生拉恩菌鑒定錯誤。Vitek MS系統未鑒定出結果的菌株共有8株，包括聚團腸桿菌1株，雷極普羅威登菌1株，棲稻假單胞菌2株，放射根瘤菌1株，創傷弧菌1株，芳香類香味菌1株和衣氏放線菌1株，此外，Vitek MS系統將1株宋內志賀菌鑒定錯誤。對于研究中的1株衣氏放線菌二者均未鑒定出結果，歸因于這個菌種并不存在于二者的數據庫中。

表1 Bruker Biotyper和Vitek MS系統的鑒定結果(株)Table 1 Results of identification by Bruker Biotyper system and Vitek MS system(isolates)

3 討論

近年來，MALDI-TOF-MS作為一種新興的微生物鑒定技術，得到眾多研究的認可[1-14]。與傳統生化表型鑒定和分子生物學鑒定方法相比，以MALDITOF-MS為基礎的鑒定系統是一種準確快速、經濟有效的微生物鑒定系統[5，9-11]。將MALDI-TOF-MS與實驗室信息系統和其他自動化設備連接起來，以此而形成的多種鑒定方法正在應用或發展中[12]。現今，一些操作簡易的商業化質譜儀已經在常規微生物鑒定中得到應用，例如德國Bruker Daltonics公司的Burker Biotyper系統、法國bioMérieux公司的Vitek MSRUO和Vitek MS系統以及法國SAS公司的Andromas檢測系統。這些系統擁有不同的圖譜數據庫和獨特的數據分析計算法則[15]，因其鑒定的獨特優勢已廣泛應用于臨床細菌鑒定的工作中。

早期研究認為質譜儀對非發酵菌[16]、沙門菌[17]等很多細菌的鑒定準確率近乎100%。而本研究中對某些非發酵菌的鑒定中存在未被鑒定出結果的現象，如Bruker Biotyper系統在1株銅綠假單胞菌和1株腦膜敗血性黃桿菌的鑒定中未鑒定出結果，而Vitek MS系統在2株棲稻假單胞菌和1株芳香類香味菌的鑒定中未鑒定出結果，原因可能在于質譜儀數據庫中無這些菌株。國內有研究報道，利用MALDI-TOF-MS對包括腸桿菌科細菌、嗜血桿菌及非發酵菌在內的9種180株革蘭陰性菌進行鑒定，符合率達到96.7%[18]，略高于本次研究，可能因其涵蓋的陰性菌種類明顯少于本次研究。

本研究中的120株革蘭陰性菌臨床分離株包括40個菌屬和81個菌種，囊括了臨床工作中絕大多數的革蘭陰性桿菌，對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬細菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌，兩種質譜儀都能進行準確鑒定。對于衣氏放線菌，由于二者數據庫中不存在此菌種，因此都未能鑒定出來。有些菌株在首次檢測中無法被鑒定，但經2～3次重復檢測后，部分菌株能得到準確鑒定，這表明操作者和樣品準備等質譜分析前階段因素有可能會影響鑒定結果[2-3，13]，例如菌株重復傳代培養會導致其無法被鑒定。因此，在常規工作中應該對首次無法鑒定的菌株進行重復檢測。而那些雖然包含在數據庫中但在重復檢測中依然未被鑒定出來的菌株，很可能是由于其產生的圖譜與數據庫中的特征圖譜不一致。

Couturier等[19]的研究發現，使用Bruker固有的數據庫，93%的菌株至少能被鑒定到屬的水平，只有66%的菌株能被鑒定到種的水平。而通過對數據庫進行自定義補充后，所有的菌株能被鑒定到屬的水平，79%的菌株能被正確鑒定到種的水平。研究者把上述現象歸結于：儀器生產商數據庫中生物個體單一的參考光譜并不能代表其他實驗室分離的典型菌株，也就是說菌株的多樣性影響了鑒定的準確性。因此，數據庫中較多的參考光譜可使鑒定結果更為可靠。可見，圖譜數據庫的組成和質量對質譜儀的正確鑒定至關重要，這與本研究結果基本一致。

針對單一的MALDI-TOF-MS鑒定系統和傳統鑒定方法進行比較的研究較多，直接對兩種MALDI-TOF-MS系統進行比較和評估的研究還較少。Chen等[20]報道了BrukerBiotyper和VitekMSIVD系統采用MALDISepsityper蛋白質提取法對181株（代表20個菌屬和40個菌種）來自血培養物的細菌的直接鑒定，經統計分析，P=0.016，總體上Bruker Biotyper系統（97.8%）的正確鑒定水平高于Vitek MSIVD系統（92.3%）。

為提高MALDI-TOF-MS對細菌的鑒定能力，儀器制造商有必要對圖譜數據庫逐步完善，使其涵蓋盡量多的菌屬和菌種。此外，考慮到菌株標本來源多樣性、地域來源差異性和不同分離年限，數據庫中應包含同一個菌種采集的多個分離株的圖譜，并允許用戶將本地分離的典型菌株作為參考菌株填充到自定義數據庫中，對數據庫進行最有效的補充，以便更大地發揮其鑒定作用。

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（2014-07-22收稿 2014-09-03修回）

（責任編委 曲 芬 本文編輯 王 姝）

Com parison of Bruker Biotyper system and Vitek MS system in the identification of clinical Gram-negative isolates

WANG Lu,YANG Liu,RENWei,CHU Mei-ling,MENG Dong-ya,XUEWen-cheng*
Department of Laboratory,General Hospital of Shenyang Military Area Command,Shenyang,Liaoning 110016,China
*Corresponding author,E-mail:13309884078@189.cn

Objective To compare and evaluate the use of twomatrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry(MALDI-TOF-MS)systems,Bruker MALDIBiotyper system(Bruker Biotyper system)and MALDI-TOF Vitek MS system(Vitek MS system)in the identification of Gram-negative clinical isolates.Methods A total of 120 Gram-negative isolates were collected from blood,urine,cerebrospinal fluid,secretion,wound swab and sputum samples from patients treated in General Hospital of Shenyang Military Area Command from Mar.2012 to Jan.2013.Each isolate was firstly identified to the species by Vitek 2 Compact system,and then identified by Bruker Biotyper system and Vitek MSsystem.Isolates differently identified by the three systemswere finally confirmed by 16S rDNA sequencing as the gold standard.Results Of the 120 isolates,95.0%were correctly identified to thegenus levelby Bruker Biotyper system and 92.5%by Vitek MSsystem,and 89.2%were correctly identified to the species level by Bruker Biotyper system and 86.7%by Vitek MSsystem,and the differencesbetween them were notsignificant.Conclusions Bruker Bio-typersystem and Vitek MSsystem were notsignificantly different in the accuracy ratesof identifying clinicalGram-negative isolates. In addition,the identification resultsof the two systemsare closely related to theirown databasesofpictorialworks.

spectrometry,mass,matrix-Assisted laser desorption-ionization;pictorialworks;Gram-negative bacteria

R313

A

1007-8134(2014)05-0282-05

110016，沈陽軍區總醫院檢驗科（王璐、楊柳、任微、褚美玲、孟冬婭、薛文成）

薛文成，E-mail:13309884078@189.cn