埃博拉病毒感染性標(biāo)本在生物安全三級實驗室的臨床檢驗與生物安全防護

鄭江花，胡綠蔭，李海聰，王剛，毛會軍，曹宇碩，盧洪洲

·特別報道·

埃博拉病毒感染性標(biāo)本在生物安全三級實驗室的臨床檢驗與生物安全防護

鄭江花，胡綠蔭，李海聰，王剛，毛會軍，曹宇碩，盧洪洲

本文參考美國疾病預(yù)防控制中心的最新資訊和中國疾病預(yù)防控制中心制定的《埃博拉出血熱個人防護指南（第二版）》，介紹當(dāng)前在生物安全三級實驗室開展埃博拉病毒感染者血液標(biāo)本臨床檢驗策略的最新研究進展，主要包括臨床檢驗的操作流程以及操作人員必要的生物安全防護要點。

埃博拉病毒屬；臨床試驗；檢疫

埃博拉病毒是病毒性出血熱的病原體之一，在人類和非人類的靈長類動物（如猴子、大猩猩和黑猩猩）中引起的疾病往往非常嚴(yán)重，甚至致命。自1976年在剛果共和國埃博拉河附近首次發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒感染病例后，2014年的大暴發(fā)是埃博拉病毒在西非發(fā)生的迄今為止最大的一次感染事件，截至2014年10月20日已有9191例感染埃博拉病毒，其中4546例死亡[1]。埃博拉病毒傳染性極強，可通過直接接觸患者的血液或分泌物（尿液、糞便、精液和乳汁等）或是被污染的物體表面感染[2]。埃博拉病毒歸屬于絲狀病毒科埃博拉病毒屬，有5個亞型，其中4個亞型可引起人類疾病，分別是扎伊爾亞型、蘇丹亞型、科特迪瓦亞型和本迪布焦亞型?！度碎g傳染的病原微生物名錄》[3]將埃博拉病毒歸屬于第一類、四級生物危害等級的病原微生物，處理未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料必須在生物安全三級（biosafety level-3 laboratory,BSL-3）實驗室內(nèi)進行。2014年8月26日我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會專家批準(zhǔn)上海市公共衛(wèi)生臨床中心BSL-3實驗室的埃博拉病毒擴項申報，專家對于如何在BSL-3實驗室內(nèi)開展埃博拉病毒感染者血液標(biāo)本的血細(xì)胞分析和臨床生物化學(xué)檢驗給予了一系列指導(dǎo)意見。本文參考美國疾病預(yù)防控制中心的最新資訊和中國疾病預(yù)防控制中心制定的《埃博拉出血熱防控方案（第二版）》[2，4]，介紹上海市公共衛(wèi)生臨床中心在BSL-3實驗室開展埃博拉病毒病感染者的血液標(biāo)本臨床檢測策略的最新研究進展。

1 開展埃博拉應(yīng)急檢測的硬件設(shè)施

《人間傳染的病原微生物名錄》[3]將埃博拉病毒歸屬于第一類、四級生物危害等級的病原微生物，屬于高致病性病原微生物，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料必須在BSL-3實驗室內(nèi)進行。感染者血液在BSL-3實驗室內(nèi)進行臨床檢測（如血細(xì)胞分析和臨床生物化學(xué)檢測）時需要相應(yīng)的儀器設(shè)備，如全自動血細(xì)胞分析儀和生化分析儀?？蓪⑷詣友?xì)胞分析儀和生化分析儀放置于BSL-3實驗室的生物安全柜內(nèi)，儀器的大小須考慮符合安全柜內(nèi)空間，儀器應(yīng)具備較高的自動化程度，可以自動吸樣以盡量避免工作人員進行打開標(biāo)本蓋的操作，減少氣溶膠的產(chǎn)生。我們選擇SYSMEX XS-1000i全自動血細(xì)胞分析儀（SYSMEX株式會社，日本）和FUJIDRI-CHEM4000全自動干式生化分析儀（富士公司，日本）以滿足生物安全防護的需要。

2 BSL-3實驗室內(nèi)個人防護

在BSL-3實驗室內(nèi)的所有操作必須符合《埃博拉出血熱個人防護指南（第二版）》[4]的三級個人防護要求，做好個人防護用品的穿戴：穿一次性防護服、隔離衣、防滲漏膠鞋、短鞋套及防滲漏長鞋套，戴醫(yī)用N95口罩和工作帽、正壓防護面罩及雙層防滲漏乳膠手套。嚴(yán)格按照BSL-3生物安全防護用品的穿戴和脫卸流程操作，脫卸一次性防護用品時須注意每脫卸1件防護用品前都先用75%酒精噴灑防護用品的外表面進行消毒。

3 臨床檢測流程

由中心應(yīng)急辦統(tǒng)一指揮和協(xié)調(diào)，通知檢驗科負(fù)責(zé)人準(zhǔn)備開始承擔(dān)感染者的臨床檢驗工作。

3.1 準(zhǔn)備檢驗科負(fù)責(zé)人接到通知后，立即召開科室緊急啟動會議，傳達上級指示，布置當(dāng)前任務(wù)。聯(lián)系BSL-3實驗室負(fù)責(zé)人，做好儀器和試劑等準(zhǔn)備工作。根據(jù)檢驗科應(yīng)急工作人員安排表組織落實檢測人員，檢測人員按照《埃博拉出血熱個人防護指南（第二版）》[4]的三級個人防護要求做好個人防護，準(zhǔn)備接收患者樣本進行檢測。

3.2 標(biāo)本運送病房將開展相應(yīng)檢驗項目的標(biāo)本經(jīng)專人專車送往應(yīng)急實驗室（BSL-3），標(biāo)本運送人員應(yīng)按照《埃博拉出血熱應(yīng)急工作手冊》[5]中的二級個人防護流程做好防護用品的穿戴：戴醫(yī)用N95口罩和防護眼罩，穿工作服、隔離衣、二層鞋套及防滲漏長靴，戴雙層乳膠手套和工作帽。收集標(biāo)本時必須仔細(xì)檢查采樣容器是否完好無損并蓋緊，采樣容器上是否寫明患者姓名、病區(qū)/床號、標(biāo)本的種類及采樣時間（護士填寫），確認(rèn)樣本合格并在標(biāo)本接收登記本上做好登記后，對標(biāo)本外表面噴灑75%酒精消毒，放入印有生物危害標(biāo)識的“應(yīng)急檢測標(biāo)本專用運送箱”（運輸包裝分類：UN2814類型A類感染性材料）（圖1），用合適的容器固定，以免顛簸導(dǎo)致泄漏或破碎，再對轉(zhuǎn)運箱的外表面噴灑75%酒精消毒。氣溫超過25℃須在“應(yīng)急檢測標(biāo)本專用運送箱”內(nèi)放置醫(yī)用冰袋，冰袋上放固定容器。標(biāo)本運送人員在離開病區(qū)時，以75%酒精噴灑手套、外層隔離服和鞋套。標(biāo)本運送人員將“應(yīng)急檢測標(biāo)本專用運送箱”置于避光、防雨、防震的標(biāo)本運送車上，須非常仔細(xì)、小心地送至應(yīng)急實驗室1樓的標(biāo)本傳遞窗內(nèi)，以紫外線照射表面15min。

圖1 傳染性標(biāo)本包裝與運輸說明示意圖[6]Figure 1 Packaging and transporting diagram of infectious specimen[6]

一名生物安全部實驗室人員將“應(yīng)急檢測標(biāo)本專用運送箱”轉(zhuǎn)運至BSL-3實驗室準(zhǔn)備間的傳遞窗內(nèi)，此時一名臨床檢測實驗室工作人員與另一名生物安全部工作人員做好三級個人防護，進入BSL-3實驗室準(zhǔn)備間。打開傳遞窗內(nèi)的“應(yīng)急檢測標(biāo)本專用運送箱”，以75%酒精噴灑后取出箱內(nèi)的內(nèi)層樣本管包裝桶并將其轉(zhuǎn)移至核心區(qū)的傳遞窗中，打開紫外線照射5min。工作人員來到BSL-3實驗室核心區(qū)，在生物安全柜內(nèi)打開內(nèi)層樣本管包裝桶蓋，取出標(biāo)本管，即1支2ml EDTA抗凝全血管和1支3.5ml血清管，分別用于患者的血細(xì)胞分析和臨床生物化學(xué)項目檢測。臨床生物化學(xué)檢測項目包括電解質(zhì)、肝功能和腎功能等基本臨床指標(biāo)。

3.3 標(biāo)本檢測臨床實驗室工作人員在生物安全部工作人員的配合下，按照SYSMEX XS-1000i全自動血細(xì)胞分析儀和FUJIDRI-CHEM4000全自動干式生化分析儀的操作流程，在生物安全柜內(nèi)完成標(biāo)本檢測。實驗操作的動作要輕柔，在工作臺面預(yù)先鋪上鋪巾。操作過程中禁止工作人員的手部隨意進出生物安全柜。血細(xì)胞分析的標(biāo)本無須打開標(biāo)本蓋，只須將標(biāo)本放置在SYSMEX XS-1000i全自動血細(xì)胞分析儀的進樣架上自動檢測，檢測結(jié)果會通過聯(lián)機系統(tǒng)傳送到安全柜外的LIS信息系統(tǒng)電腦上，臨床實驗室工作人員審核并發(fā)布報告。生物化學(xué)檢測的標(biāo)本須離心后才能上機檢測，離心過程容易產(chǎn)生氣溶膠，所以離心和標(biāo)本開蓋上機的一系列操作中須注意很多細(xì)節(jié)：先將帶蓋離心桶（轉(zhuǎn)頭）放置于安全柜內(nèi)，將標(biāo)本噴灑75%酒精消毒后包裹上吸水紙輕輕放入50ml塑料離心管中，再把離心管放入離心桶中，蓋好蓋子，消毒離心桶外表面后移出安全柜，高速冷凍水平離心機3000 rpm/min離心10min。離心機停止轉(zhuǎn)動后，靜止10min，然后將離心桶放入生物安全柜內(nèi)，分別打開桶蓋和50ml離心管蓋。打開50ml離心管蓋后，觀察有無樣本溢出，右手用飽含75%酒精的吸水紙握住標(biāo)本管蓋，左手用飽含75%酒精的吸水紙握住樣本管的下部分，輕輕旋轉(zhuǎn)打開標(biāo)本蓋，將標(biāo)本放入FUJIDRI-CHEM4000全自動干式生化分析儀的標(biāo)本位，開始檢測[7]。檢測結(jié)果通過聯(lián)機系統(tǒng)傳送到安全柜外的LIS信息系統(tǒng)電腦上，臨床實驗室工作人員審核并發(fā)布報告。

3.4 清場與消毒操作結(jié)束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用75%酒精擦拭外表面后移出生物安全柜放入指定地點。血細(xì)胞分析儀和生化分析儀外表面用75%酒精噴灑，作用時間10min以上。用75%酒精擦拭工作臺面、生物安全柜內(nèi)壁及臺面，并繼續(xù)運行生物安全柜30min后關(guān)閉。確定實驗區(qū)內(nèi)無本次操作遺留的物品，檢查實驗室內(nèi)壓力是否正常。實驗人員按照進出BSL-3實驗室的操作規(guī)程退出實驗室。

3.5 廢棄物處理所有剩余或廢棄標(biāo)本等污染物裝入高壓滅菌袋中，用高壓指示帶松松扎口，并用75%乙醇消毒劑噴灑袋外側(cè)后移出生物安全柜。經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，作為醫(yī)療廢棄物焚燒。未經(jīng)許可實驗室一律不保存埃博拉病毒血液樣本。

4 安全危險及其防護措施

在處理樣品的操作步驟中，有可能產(chǎn)生的生物危險是當(dāng)打開標(biāo)本容器蓋時，樣品管輕微振蕩后有可能產(chǎn)生氣溶膠；樣本量過多時，有可能發(fā)生樣本溢出；離心后有可能產(chǎn)生氣溶膠和離心管破裂。埃博拉病毒作為高致病性病原微生物，目前已經(jīng)被美國疾病預(yù)防控制中心列為管制病原[8]，所有未滅活標(biāo)本的臨床檢測須嚴(yán)格遵循BSL-3操作水平的要求，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)處理標(biāo)本，穿隔離衣，戴雙層乳膠手套、帽子、N95口罩和正壓防護面罩進入BSL-3實驗室。工作人員在BSL-3實驗室內(nèi)操作樣本時，在做好個人防護的同時，還須知曉一些個人生物安全防護的處理細(xì)節(jié)。

4.1 防止氣溶膠產(chǎn)生和吸入的個人防護措施應(yīng)事先在生物安全柜臺面鋪上鋪巾；帶蓋的樣品管輕微振蕩后應(yīng)靜止10min；離心機停止轉(zhuǎn)動后，靜止10min，然后將轉(zhuǎn)頭放入生物安全柜分別打開轉(zhuǎn)頭蓋和離心管蓋；標(biāo)本蓋在生物安全柜中輕輕地打開；實驗人員實驗時佩戴N95口罩和正壓防護面罩。

4.2 防止標(biāo)本溢出的個人防護措施應(yīng)事先在生物安全柜臺面鋪上鋪巾；實驗人員輕輕打開蓋，若發(fā)生樣品溢出，噴灑75%酒精消毒標(biāo)本外表面，隨后立即用飽含75%酒精的吸水紙擦拭污染區(qū)域，作用適當(dāng)時間（15min以上），擦拭結(jié)束后操作人員立即更換外層手套。

4.3 離心管破裂時的操作步驟如果儀器正在運行，應(yīng)立即關(guān)閉儀器電源，儀器保持密閉30min以使氣溶膠沉積；如果儀器已經(jīng)停止，應(yīng)保持蓋子密閉30min；所有的操作都應(yīng)戴厚橡膠手套，清理玻璃碎片時應(yīng)當(dāng)使用鑷子；所有破損的離心管、玻璃碎片、離心桶、十字軸和轉(zhuǎn)子都應(yīng)放在75%酒精內(nèi)浸泡24 h，再高壓滅菌消毒。未破損的帶蓋離心管應(yīng)放入另一個裝有消毒劑的容器中，然后回收；離心機內(nèi)腔應(yīng)用75%酒精擦拭，并重復(fù)擦拭1次，然后用水沖洗并干燥。清理時使用的所有材料都應(yīng)按感染性廢棄物處理。

綜上所述，在BSL-3實驗室內(nèi)開展埃博拉感染性標(biāo)本的血細(xì)胞分析和臨床生物化學(xué)檢驗可以在第一時間為臨床醫(yī)生提供患者必要的信息，有助于患者的對癥治療。作為臨床實驗室工作人員在檢測該高致病性病原微生物的臨床樣本時，必須嚴(yán)格遵循BSL-3操作水平要求，做好嚴(yán)格的個人防護，所有的樣本操作必須在生物安全柜內(nèi)進行。工作人員應(yīng)熟悉操作流程，在所有臨床檢驗操作過程中，動作應(yīng)該輕柔，避免發(fā)生生物安全事件，自始至終保證工作人員的人身安全為第一要務(wù)。

[1]WHO.埃博拉致西非三國4546人死亡［EB/OL］.［2014-10-19］. http://news.sina.com.cn/o/2014-10-19/052031010635.shtml.

[2]CDC.2014 Ebola outbreak in West Africa［EB/OL］.［2014-09-12］. http://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/guinea/index.htm l.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.人間傳染的病原微生物名錄［EB/OL］.［2014-09-10］.http://www.moh.gov.cn/mohbgt/pw10602/200804/20471.shtml.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.埃博拉出血熱防控方案（第二版）［J］.傳染病信息，2014，27(4):Ⅰ-Ⅱ.

[5]上海市公共衛(wèi)生臨床中心應(yīng)急辦公室.埃博拉出血熱應(yīng)急工作手冊［EB/OL］.［2014-09-01］.http://www.shaphc.org/webContent/ new_znss.aspx?coid=0&name=%e5%9f%83%e5%8d%9a%e6% 8b%89.

[6]CDC.Interim guidance for specimen collection,transport,testing, and submission for persons under investigation for Ebola virus disease in the United States［EB/OL］.［2014-09-12］.http://www.cdc. gov/vhf/ebola/hcp/interim-guidance-specimen-collection-submission-patients-suspected-infection-ebola.htm l.

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第三版［EB/OL］.［2014-09-12］.http://xidong.net/File001/File_61458. htm l.

[8]CDC.Interim guidance regarding compliancewith selectagent regulations for laboratories handling patient specimens that are known or suspected to contain Ebola virus［EB/OL］.［2014-09-12］.http: //www.cdc.gov/vhf/ebola/hcp/select-agent-regulations.html.

（2014-09-15收稿 2014-10-20修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 陳玉琪）

Clinical exam ination and personal biosafety protection for infectious specimensw ith Ebola virus in biosafety level 3 laboratory

ZHENG Jiang-hua,HU Lü-yin,LIHai-cong,WANG Gang,MAO Hui-jun,CAO Yu-shuo,LU Hong-zhou*
Shanghai Public Health Clinical Center,Fudan University,Shanghai201508,China
Correspondong author,E-mail:luhongzhou@shaphc.org

In compliance with the latest informations released by American Centers for Disease Control and Prevention(CDC) and the“Ebola hemorrhagic fever personal protection guide(second edition),”issued by China Center for Disease Control and Prevention,we present and describe here the latest research progresses about performing clinical examinations strategies for infectious blood samples with Ebola virus from patients in biosafety level 3 laboratory at present.The presenting main contents at present include standard operating procedures for clinical examinations and key points about personal biosafety protection when laboratory technicians operate in biosafety level 3 laboratory.

Ebola virus；biosafety level 3 laboratory;clinical examination;biosafty protection

R373.32

A

1007-8134(2014)05-0257-03

國家863項目（SS2014AA021403）；上海市公共衛(wèi)生臨床中心科研啟動基金（201301、201309）

201508，上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心（鄭江花、胡綠蔭、李海聰、王剛、毛會軍、曹宇碩、盧洪洲）；200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染病科（盧洪洲）

盧洪洲，E-mail:luhongzhou@shaphc.org