艾灸生成物對大鼠腦神經系統形態學的影響

周次利,吳璐一,竇傳字,劉慧榮,馮輝,崔云華,馬曉芃,趙琛,吳煥淦

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海中醫藥研究院,上海 201203)

艾灸生成物對大鼠腦神經系統形態學的影響

周次利1,吳璐一2,竇傳字1,劉慧榮1,馮輝2,崔云華1,馬曉芃1,趙琛2,吳煥淦1

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海中醫藥研究院,上海 201203)

目的 觀察不同濃度艾灸生成物對SD大鼠腦神經系統形態學的影響。方法 將40只大鼠隨機分為正常對照組、低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組,艾灸生成物與純凈氣的濃度比分別為 0.4：2.0、0.8：2.0、1.6：2.0,每天暴露 4 h,每星期5次,持續60 d;高劑量艾灸生成物恢復組經60 d高劑量艾灸生成物刺激后,在空氣中自然暴露21 d作為恢復期。正常對照組大鼠不進行任何艾灸生成物干預,常規飼養 60 d。光學顯微鏡下觀察各組大鼠大腦皮層、海馬、小腦病理形態,透射電鏡下觀察海馬超微形態。結果 各組大鼠大腦皮層、海馬、小腦細胞病理形態無明顯差異,海馬超微結構形態無明顯差異。結論 艾灸生成物對大鼠腦神經系統形態無明顯影響。

艾灸生成物;安全性;腦神經系統;形態學;大鼠

灸法最早記載于《左傳》,至今已有數千年的歷史,是一種傳統的中醫治療方法。灸法以艾為主要施灸材料,施灸過程中產生艾煙等艾灸生成物。自古就有運用艾葉煙熏治療和預防疾病的記載[1-2]。近年來,隨著人們環保及健康安全意識的提高,艾煙等艾灸生成物的安全性逐漸成為灸法研究中亟待解決的熱點問題[3]。本研究觀察不同濃度艾灸生成物對SD大鼠腦神經系統的形態學影響,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠40只,雄性,由復旦大學上海醫學院實驗動物科學部提供,體重為(160±20)g。

1.2 主要試劑與儀器

艾條(南陽市臥龍漢醫艾絨廠),HOPE-MED8053B燃煙動式基礎染毒設備(天津合普公司),8050-1型動靜洗三合一染毒柜(天津合普公司),組織包埋機(LEICA),石蠟切片機(LEICA公),LKB-Ⅰ型超薄切片機(LEICA),醫用冷藏箱(海爾),OLYMPUS BX53顯微鏡(OLYMPUS),OLYMPUS cellSens Dimension圖像分析系統(OLYMPUS),PHILIPS CM-120透射電鏡(PHILIP)。

1.3 分組

40只大鼠隨機分為5組,即正常對照組、低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組,每組8只。

1.4 艾灸生成物干預

艾條以3：1出品率的1級精制3年陳艾絨作為原材料,參照衛生部清艾條制作標準(中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑第十七冊)制成,每根艾條重25 g,長20 cm,直徑2 cm,以桑皮紙包裹,由南陽市臥龍漢醫艾絨廠提供。

在HOPE-MED8053B燃煙動式基礎染毒設備中點燃艾條,通過調節混合氣(艾灸生成物)與純凈氣的濃度比,控制不同組別大鼠的艾灸生成物刺激濃度。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組,混合氣與純凈氣的濃度比分別為 0.4：2.0、0.8：2.0、1.6：2.0。

低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組大鼠分別置于8050-1型動靜洗三合一染毒柜中,按不同濃度每天暴露4 h,每星期5 次,持續60 d;高劑量艾灸生成物恢復組經60 d高劑量艾灸生成物刺激后,在空氣中自然暴露21 d作為恢復期。正常對照組大鼠不進行任何艾灸生成物干預,常規飼養。

企業也可以只針對一種產品進行調查，考察顧客滿意度的變化指數，這就是顧客滿意度。利用讓渡價值公式計算顧客滿意度；當顧客滿意度小于0時，表明顧客不滿意；顧客滿意度大于0時，表明顧客滿意；如果兩者的差值太大，就表示顧客非常滿意。企業可以根據上述的公式，定期做一些市場推廣和調查問卷，通過對顧客的滿意度調查調整公司的服務。在市場營銷時可以根據顧客對購買商品的要求，提供相應的服務。如果顧客買到滿意的產品，就會表現與購買前不一樣的狀態。企業也可以從不同的角度去觀察顧客在購買產品的服務過程是否達到預期的效果，分析出他們所需要的產品和服務[4]。

1.5 取材與指標檢測

60 d艾灸生成物干預結束后,正常對照組、低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組大鼠稱重,按體重以 3%戊巴比妥鈉 0.1 mL/ 100 g足量麻醉大鼠,斷頭取腦,迅速分離大腦皮層、海馬、小腦。左側海馬、大腦皮層、小腦置于4%多聚甲醛溶液后固定不超過24 h,石蠟包埋、切片,備用。右側海馬置于2.5%戊二醛中,備用。

21 d恢復期結束后,高劑量艾灸生成物恢復組按上述方法同樣取材。

1.5.1 光學顯微鏡觀察

HE染色行大鼠腦組織光學顯微鏡觀察,步驟如下。

切片常規脫蠟至水,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min,100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min;雙蒸水5 min×2;蘇木素3 min;自來水沖洗10 min;鹽酸乙醇3 s;流水10 min;伊紅1 min。梯度乙醇上行脫水,70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇各30 s。二甲苯透明,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min;中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察大鼠腦組織,拍片。

1.5.2 透射電鏡觀察

將固定好的標本用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min×3,1%餓酸固定液固定2～3 h,0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min×3。4℃冰箱內50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇90%丙酮(1：1)、90%丙酮各15～20 min脫水后,室溫100%丙酮脫水15～20 min×3。室溫純丙酮＋包埋液(2：1)浸透3～4 h后,室溫純丙酮＋包埋液(1：2)過夜,37℃純包埋液浸透2～3 h。37℃過夜、45℃12 h、60℃24 h以固化標本。切片,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,PHILIPS CM-120透射電鏡觀察,拍片。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織病理形態學變化

如圖 1所示,正常對照組大鼠大腦皮層層次結構清晰,錐體細胞、顆粒細胞、梭形細胞等神經元清晰可見,結構完整,排列整齊,層次緊密,輪廓清晰,染色均勻,未見神經元變性、壞死。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組大鼠大腦皮層病理形態未見明顯異常。

圖1 各組大鼠大腦皮層病理形態學變化(標尺=20 μm)

如圖2所示,正常對照組大鼠海馬層次結構清晰,錐體細胞、顆粒細胞等神經元清晰可見,結構完整,排列整齊,層次緊密,輪廓清晰,染色均勻,未見神經元變性、壞死。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組大鼠海馬病理形態未見明顯異常。

圖2 各組大鼠海馬病理形態學變化(標尺=20 μm)

如圖3所示,正常對照組大鼠小腦層次結構清晰,顆粒細胞、浦肯野細胞等神經元清晰可見,結構完整,排列整齊,層次緊密,輪廓清晰,染色均勻,未見神經元變性、壞死。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組大鼠小腦病理形態未見明顯異常。

圖3 各組大鼠小腦病理形態學變化(標尺=20 μm)

2.2 透射電鏡觀察

如圖4所示,正常對照組大鼠海馬神經元核圓,染色質淺,核仁與核膜孔明顯可見,細胞質線粒體數量不多,卵圓形或短管狀,板層嵴粗面內質網與游離核糖體豐富,高爾基器位于核周,有少量脂褐素,微管和神經絲可辨。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復組大鼠海馬超微結構形態未見明顯異常。

圖4 各組大鼠海馬超微結構形態學變化(標尺=1 μm)

3 討論

艾煙等艾灸生成物的安全性評價是近年來灸法研究的熱點。艾煙等艾灸生成物是否對機體與環境產生不良影響是影響灸法發展的重要因素。化學研究顯示,艾煙中既含有對人體有益的成分,亦含有可能對人體不利的成分[4]。Wheeler等[5]報道,在正常條件下,艾煙揮發性物質和CO含量均不會導致安全危害;艾煙的檢測結果與城市環境中報告結果基本水平相當;極端情況下,艾條燃燒產生的艾煙中,只有丙烯醛、對苯二酚2種揮發性物質水平和CO水平等于或大于安全接觸水平。黃茶熙等[6]監測并分析京津地區夏季艾灸診室和灸療館內可吸入顆粒物(PM10),顯示京津地區艾灸場所內存在以艾燃燒生成物為主要來源的可吸入顆粒物(PM10)污染,艾灸場所內PM10的平均質量濃度(3.54 mg/m3)超過醫院候診室衛生標準(GB9671-1996)中規定的最高限值(0.15 mg/m3),同時也超過同時間段北京市和天津市大氣PM10質量濃度的月平均值(0.92 mg/m3和0.83 mg/m3)。目前,尚未見大樣本的艾灸生成物流行病學調查研究報告。Park等[7]檢索Web of Science、Cochrane Central Register of Controlled Trials等14個數據庫相關文獻,系統評價艾灸的不良事件,顯示艾煙可引起少數有慢性咽炎病史的患者對艾灸煙霧過敏發生咳嗽,通風后改善;少數患者發生艾灸過敏,停灸或抗過敏治療后過敏癥狀、體征消失。蘭蕾等[8]以SD大鼠為試驗對象,進行艾煙的急性毒理試驗,結果表明艾煙對大鼠的半數致死濃度LC50為11117 mg/m3,根據世界衛生組織(WHO)的標準得出艾煙的毒性分級為微毒。

新近研究表明艾煙具有一定機體保護作用和細胞毒作用。一定濃度和時間的艾煙可提高快速老化小鼠血清及大腦抗氧化能力,減少自由基代謝產物,增強自由基清除能力,從而起到顯著的抗衰老作用[9-10]。艾煙和/或艾燃燒灰燼水提取物可選擇性對腫瘤細胞產生細胞毒作用,抑制鼠巨噬細胞樣細胞Raw264.7一氧化氮和誘導型一氧化氮合酶表達,具有抗癌和抗炎潛力,可成為治療腫瘤和炎癥的新型佐劑[11-16]。劉平等[17]報道不同濃度艾煙干預6個月(20 min/d)對大鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞及CD3+CD4+/CD3+CD8+無影響,但可下調CD4+T細胞中CD4+CD25+Treg細胞的比例,艾煙預處理可能通過該途徑發揮對機體的免疫調節作用,增強機體抗腫瘤作用。胡海等[18-19]報道艾煙冷凝物對肺泡Ⅱ型上皮細胞A549形態、數量、活性及凋亡呈濃度依賴性或時間濃度依賴性,0.12 g/L濃度的艾煙冷凝物作用于肺泡Ⅱ型上皮細胞A549 12 h后可顯著提高細胞存活率。韓麗等[20]研究顯示艾煙冷凝物具有潛在的遺傳毒性,尚未發現劑量效應關系。可見,艾煙等艾灸生成物對機體作用的安全性與刺激濃度、刺激時間有一定相關性。

腦是機體重要的生命中樞。大腦皮層、海馬、小腦與機體學習和語言等高級認知功能,軀體感覺,聽覺,嗅覺,視覺,記憶,情感,運動控制等密切相關。崔瑩雪等[21]報道艾煙可影響快速老化模型小鼠腦內氨基酸類神經遞質谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸表達,認為艾煙可通過調整腦內氨基酸的異常代謝達到抗衰老的效應。本研究中,我們采用透射電鏡觀察各組大鼠海馬超微形態,光學顯微鏡觀察大腦皮層、海馬、小腦形態,探討不同濃度艾灸生成物對SD大鼠腦神經系統形態學的影響。結果表明各組大鼠海馬超微結構形態無明顯差異,大腦皮層、海馬、小腦細胞病理形態無明顯差異,顯示本研究艾灸生成物濃度與干預時間對大鼠腦神經系統形態無明顯影響。蘭蕾等[22]研究結果亦顯示不同濃度艾煙對大鼠腦組織形態無明顯毒性作用,與本研究結果一致。

今后的研究中,可進一步探討艾灸生成物不同刺激方式對機體各器官、組織、細胞、蛋白、基因、代謝產物等的結構和功能的影響,開展艾灸生成物接觸者流行病學調查,從而獲取艾灸生成物安全性范圍,制定艾灸生成物安全性評價標準,促進灸法的臨床應用與推廣,推動灸法的傳承與創新。

[1] 林永青,趙百孝.艾灸防治疫疾的歷史與現狀[J].遼寧中醫雜志, 2010,37(S1)：279-280.

[2] 蘭蕾,張國山,石佳,等.艾煙的應用和不良反應研究進展[J].中華中醫藥學刊,2012,30(1)：48-51.

[3] Li J, Zhao BX. Safety Concerns about the Application of Moxa[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2010,8(3)：145-148.

[4] Zhou CL, Feng XM, Wang JH, et al. Research advance on moxa smoke[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2011,9(2)：67-72.

[5] Wheeler J, Coppock B, Chen C. Does the burning of moxa (Artemisia vulgaris) in traditional Chinese medicine constitute a health hazard[J]. Acupunct Med, 2009,27(1)：16-20.

[6] 黃茶熙,趙百孝,劉平,等.京津地區艾灸場所夏季可吸入顆粒物(PM10)的質量濃度及微觀形貌分析[J].中華中醫藥雜志,2012,27 (12)：3104-3108.

[7] Park J E, Lee S S, Lee M S, et al. Adverse e vents of m oxibustion: a systematic r eview[J]. Complement T her Med, 2010,18(5)：215-223.

[8] 蘭蕾,常小榮,譚靜,等.艾煙的急性毒理試驗[J].光明中醫,2011, 26(10)：1992-1995.

[9] 許煥芳,崔瑩雪,黃茶熙,等.艾燃燒生成物對快速老化模型小鼠SAMP8血清抗氧化酶的影響[J].中國針灸,2012,32(1)：53-57.

[10] 孟笑男,徐煥芳,崔瑩雪,等.艾燃燒生成物對快速老化模型小鼠大腦 SOD、MDA和 GSH-Px的影響[J].環球中醫藥,2011,4(6)：413-415.

[11] Sakagami H, Matsumoto H, Satoh K, et al. Cytotoxicity and radical modulating activity of Moxa smoke[J]. In Vivo, 2005,19(2)：391 -397.

[12]Sarath VJ,So C S,Won YD, et a l. Artemisia princeps va r or ientalis induces a poptosis i n hu man b reast cancer M CF-7 c ells[J]. Anticancer Res, 2007,27(6B)：3891-3898.

[13]Hatsukari I,Hitosugi N,Ohno R, et al. Partial pur ification of cytotoxic substances from moxa extract[J]. Anticancer Res, 2002,22 (5)：2777-2782.

[14]Hitosugi N,Ohno R,Hatsukari I, et al. Diverse biological activities of moxa extract and smoke[J]. In Vivo,2001,15(3)：249-254.

[15]Hitosugi N,Ohno R,Hatsukari I, et al. Induction of cell death by pro-oxidant action of Moxa smoke[J]. Anticancer Res,2002,22(1A)：159-163.

[16]Matsumoto H,Shimada J,Nagasaka H, et al. Inhibition by Moxa smoke of NO p roduction and iNOS expression in mouse macrophagelike cells Raw 264.7[J].In Vivo, 2005,19(2)：471-474.

[17] 劉平,潘秀頡,韓麗,等.長期艾煙干預對Wistar大鼠外周血T淋巴細胞亞群及CD4+CD25+Treg的影響[J].中國針灸,2013,33(2)：145-148.

[18] 胡海,趙百孝,鄔繼紅,等.艾煙冷凝物對肺泡Ⅱ型上皮細胞 A549活性及凋亡的影響[J].北京中醫藥大學學報,2012,35(6)：426-430.

[19] 胡海,趙百孝,鄔繼紅,等.艾煙冷凝物對肺泡Ⅱ型上皮細胞 A549形態及活性的影響[J].北京中醫藥大學學報：中醫臨床版,2012, 19(6)：13-15.

[20] 韓麗,劉平,胡海,等.艾煙中可吸入顆粒誘發染色體畸變效應的實驗研究[J].中國中醫藥信息雜志,2013,20(1)：34-36.

[21] 崔瑩雪,許煥芳,劉平,等.艾煙對快速老化模型小鼠腦內氨基酸類神經遞質含量的影響[].中國中醫藥信息雜志,2013,20(10)：29-31.

[22] 蘭蕾,常小榮,張國山,等.艾煙對大鼠病理組織切片和肺HSP70及Caspase-9表達的影響[].中華中醫藥雜志,2012,27(4)：1042-1047.

Effect of Moxibustion-produced Substances on the Morphology of the Nervous System in Rat Brain

ZHOU Ci-li1, WU Lu-yi2,DOU Chuan-zi1, LIU Hui-rong1, FENG Hui2, CUI Yun-hua1, MA Xiao-peng1, ZHAO Chen2, WU Huan-gan1.
1.Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China; 2.Shanghai Academy o f Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

O bjective To i nvestigate th e e ffects o f d ifferent c oncentrations o f m oxibustion-produced s ubstances on the m orphology of t he nervous system in S D r at brain.MethodForty r ats w ere r andomly al located t o normal c ontrol, low-dose moxibustion-producedsubstances,middle-dose moxibustion-produced substances,high-dose moxibustion-produced substances and high-dose moxibustion-produced substances restoration groups. The concentration ratio of moxibustion-produced substances to pure air was 0.4:2.0 in t he l ow-dose m oxibustion-produced s ubstances g roup, 0.8:2.0 in th e m iddle-dose m oxibustionproduced substances group and 1.6:2.0 in the high-dose moxibustion-produced substances group. These three groups were exposed 4 hrs daily, 5 times a week, for 60 consecutive days. The high-dose moxibustion-produced substances restoration group was stimulated with high-dose moxibustion-produced substances for 60 days and then exposed to air for 21 days as a restoration stage. The normal control group of rats was not treated with any moxibustion-produced substances and routinely fed for 60 days. The pathological forms o f cer ebral co rtex, hippocampi and cerebella were obs erved by opt ical m icroscopy a nd hippocampal ultrastructures, by transmission e lectron microscopy in e very g roup of r ats.ResultThere were n o s tatistically s ignificant d ifferences i n t he pathological forms of cerebral cortex, hippocampi and cerebella, and hippocampal ultrastructures between various groups of rats.ConclusionMoxibustion-produced substances have no marked effect on the morphology of the nervous system in rat brain.

Moxibustion-produced substances; Safety; The nervous system in the brain; Morphology; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.06.0495

1005-0957(2014)06-0495-04

2014-01-15

國家自然科學基金項目(81102637);上海高校青年教師培養資助計劃項目(SZY11067);國家重點基礎研究發展計劃項目(2009CB522900)

周次利(1980 - ),女,助理研究員,博士,研究方向為艾及艾灸生成物安全性評價與針灸治療胃腸疾病的臨床與基礎研究,E-mail： zhoucili2010@126.com

趙琛(1973 - ),女,主任醫師,E-mail：chris_0127@126.com