隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠結腸成纖維細胞 CTGF、FN、Smad表達的影響

安彩萍,黃燕,馬曉芃,吳煥淦,施征,楊玲,竇傳字,洪玨

(1.復旦大學附屬婦產科醫院,上海 200011;2.上海中醫藥大學,上海 201203;3.上海市針灸經絡研究所,上海200030)

·“973計劃”專欄·

隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠結腸成纖維細胞 CTGF、FN、Smad表達的影響

安彩萍1,黃燕2,馬曉芃3,吳煥淦3,施征3,楊玲3,竇傳字3,洪玨3

(1.復旦大學附屬婦產科醫院,上海 200011;2.上海中醫藥大學,上海 201203;3.上海市針灸經絡研究所,上海200030)

目的 觀察隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠結腸成纖維細胞(conlonic fibroblast,CFB)CTGF、FN蛋白和Smad3、Smad7 mRNA表達的影響,探討隔藥灸治療克羅恩病腸纖維化的作用機制。方法 SD大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥灸組和西藥組。在成功制備克羅恩病腸纖維化大鼠模型的基礎上,隔藥灸組取天樞穴(雙)、氣海穴進行治療,西藥組以美沙拉嗪灌胃治療。各組治療干預結束后,留取結腸組織,分離并體外培養大鼠CFB。采用免疫細胞化學法觀察各組大鼠CFB的CTGF、FN蛋白表達,應用實時熒光定量PCR技術檢測各組大鼠CFB的Smad3、Smad7 mRNA表達。結果 與正常組比較,模型組大鼠CFB的CTGF、FN蛋白表達升高(均P＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組CFB的CTGF、FN蛋白表達降低(均P＜0.01)。各組大鼠比較,CFB的Smad3和Smad7 mRNA表達變化均不顯著(均P＞0.05)。結論 隔藥灸能下調克羅恩病腸纖維化大鼠腸成纖維細胞CTGF、FN的蛋白表達。

隔藥灸;克羅恩病;腸纖維化;成纖維細胞;CTGF;FN

克羅恩病(Crohn's disease,CD)是一種病因未明的從口腔至肛門的消化道任何一段均可受累的消化管壁全層性炎癥,但以末端回腸與鄰近結腸多見。腸纖維化是其常見的并發癥,可發生于CD病程中任一時段[1]。在CD中,腸纖維化被看作是一種對損傷過度的愈合反應,旨在修復黏膜,但是重度腸纖維化可能導致管腔的臨界狹窄或狹窄,甚至由狹窄而發展為腸閉塞[2-4]。目前,尚無特效的抗纖維化藥物,60%以上的患者最終需要手術或機械治療[5-6]。

腸纖維化是一種慢性和漸進性的過程,其特征在于由細胞外基質(extracellular matrix,ECM)如膠原蛋白、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)等的過度沉積而導致的硬化和/或所涉及的組織的瘢痕形成[3,6]。ECM的產生與纖維化細胞的活性和各種生長因子有關[7],其中CFB是ECM的主要細胞來源,其異常增殖和過量產生的ECM是導致腸纖維化的直接原因。轉化生長因子(transforming growth factor-beta1,TGF-β)被認為是多種炎癥性疾病及纖維化疾病進程的主要驅動力,其下游因子——結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)與纖維化疾病密切相關[8],常介導TGF-β的促纖維化作用[9]。研究表明CTGF可刺激CFB的增殖和ECM的沉積,CFB可能通過CTGF的過度表達而誘發CD的腸狹窄,CTGF在狹窄性克羅恩病的CFB中表達增強[10]。TGF-β誘導CTGF表達可通過Smad通路調控[11-12];TGF-β通過CTGF啟動子上的一種Smad3功能性結合位點來誘導CTGF的表達[13],該位點突變可消除TGF-β誘導的CTGF表達或減少基礎CTGF表達,而此作用可被Smad7明顯抑制。本研究擬觀察隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠結腸成纖維細胞CTGF、FN蛋白表達及Smad3、Smad7 mRNA表達的影響,探討艾灸治療克羅恩病腸纖維化的作用機制,以期為針灸防治腸纖維化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級,雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠,體重(150±20)g,由上海中醫藥大學實驗動物中心提供[實驗動物質量合格證為SCXK(滬)2003-0003]。

1.2 主要試劑及儀器

5%(W/V)TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)(Sigma公司);美沙拉嗪腸溶片(佳木斯鹿靈制藥有限責任公司); DMEM/F-12培養液(Hyclone公司);胎牛血清(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物材料有限公司); 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(Gibco公司);一抗(Santa cruz公司);FQ-PCR試劑盒(廣州達安生物技術有限公司);Trizoltm(聯合生物集團公司);CO2培養箱(NAPCO公司,法國);超凈工作臺(Heraeus公司,德國);光學顯微鏡(Olympus公司,日本);倒置相差顯微鏡(Nikon公司,日本);MOTIC圖像分析系統(麥克奧迪實業集團有限公司);低溫高速離心機(德國);移液器(吉爾森公司);TYPEB2生物安全柜(BAKER公司,美國);熒光定量PCR儀(ABI公司,美國)。

1.3 模型制備

應 用 2,4,6-三 硝 基 苯 磺 酸 (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)制備克羅恩病腸纖維化大鼠模型[14-15]。各組大鼠灌腸前24 h禁食、不禁水。將無水乙醇加雙蒸水,配成50%乙醇,然后將5%(W/V)的TNBS與50%的乙醇按2：1比例混合成TNBS灌腸液。造模大鼠以TNBS灌腸液3 mL/kg(含TNBS 100 mg/kg)灌腸。用改良型灌胃針連接注射器,抽取適量灌腸液,大鼠體位為頭下尾上,灌腸時灌胃針緩慢插入肛門6～8 cm,注入灌腸液,拔出灌胃針后再將大鼠倒立1 min左右,以防藥液溢出。正常組大鼠用相同體積0.9%氯化鈉注射液灌腸。每隔7 d重復灌腸1次,共4次。

1.4 分組與治療

大鼠模型制備成功后,按體重根據隨機數字表隨機分為模型組、隔藥灸組和西藥組,并與正常大鼠作對照。

隔藥灸組采用隔附子餅灸,取雙側天樞穴、氣海穴。藥餅配方包括附子(廣西)、肉桂(四川)等藥,研成細粉,灸前用黃酒調和藥粉拌成糊狀,制成直徑0.5 cm、厚0.3 cm大小藥餅。艾炷選精制艾絨約90 mg,制成小椎體狀。每日隔藥餅灸1次,每次每穴灸2壯,共治療10 d。

西藥組采用美沙拉嗪稀釋液灌胃,每日投藥量按成人(70 kg體重,4 g/d)與大鼠(200 g體重)56：1比例[16],每日2次,共治療10 d。

正常組與模型組不進行任何治療,只作與隔藥灸組相同的抓取與固定。

1.5 結腸成纖維細胞分離與體外培養

治療結束后,斷頸法處死大鼠,參照文獻[17]用消化法進行大鼠CFB原、傳代的培養。剪取3 cm結腸,用無菌雙蒸水反復沖洗,將組織剪成為 1 mm×1 mm×1 mm的塊狀,加入適量 0.25%胰酶-0.01%EDTA消化液,室溫攪拌消化20 min,棄上清,重新加入適量0.25%胰酶-0.01%EDTA消化液,5%CO2培養箱 37℃消化 20 min,收集上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液終止消化,4℃750 rpm離心8 min,棄上清液,加入4 mL含 10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液,重懸細胞計數,并調整細胞濃度,按1×105個/mL接種于25 cm×25 cm培養瓶中,加入含 10%FBS的DMEM/F-12培養液,濕度95%、5%CO2培養箱中37℃培養,培養2 h后,換液1次,純化腸成纖維細胞。每2～3 d換液1次,待細胞生長融合至90%,消化傳代,收集CFB后進行指標檢測。

1.6 指標檢測

1.6.1 大鼠結腸成纖維細胞的鑒定

采用免疫細胞化學染色檢測大鼠結腸成纖維細胞波形蛋白和結蛋白的表達。

1.6.2 大鼠結腸成纖維細胞CTGF、FN的表達

采用EnVision二步法檢測。細胞爬片,95%乙醇固定,3%過氧化氫室溫孵育5 min,PBS洗片,5%正常羊血清室溫孵育30 min,滴加適量抗CTGF抗體、FN抗體(4℃孵育18 h,PBS洗3次,滴加適量二抗,37℃孵育30 min,PBS洗3次,蘇木素復染1 min,溫水返藍,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片并鏡檢。采用MMOTICAM6.0圖像分析系統,進行圖像分析。

1.6.3 大鼠結腸成纖維細胞Smad3、Smad7 mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測。按照TRIzol說明書抽提細胞總RNA。取出 RT-PCR試劑盒解凍,將RNA逆轉錄cDNA。轉錄cDNA逆轉錄體系,為5 ×逆轉錄buffer,上游引物F,上游引物R,dNTPs,逆轉錄酶 MMLV,DEPC水,總體積 20 μL,反應條件為 37℃1 h,95℃5 min,滅活MMLV。實時熒光定量PCR(FQ-PCR)體系,試劑分別是Taq酶、dNTPs、上下游引物、ddH2O、10×buffer、熒光標記探針。擴增條件：①93℃ 2 min,②93℃15 s、55℃1 min40個循環。引物序列見表1。反應完數據保存。

應用 ABI7300型熒光定量 PCR儀數據軟件(ABI Prism 7300 SDS Software)分析。Smad3、Smad7 mRNA的相對表達量以 2-ΔCt×100%表示(ΔCt=目的基因Ct值－內參基因Ct值)。

表1 各基因引物和探針序列

1.7 統計學方法

采用SPSS15.0統計分析軟件,對各組數據進行正態分布和方差齊性檢驗,若正態分布、方差齊性,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計,組間兩兩比較則采用LSD檢驗。若方差不齊,采用Games-Howell檢驗分析。統計結果以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸成纖維細胞的鑒定

應用免疫細胞化學染色法鑒定大鼠結腸成纖維細胞。結果發現從大鼠結腸分離培養的細胞,波形蛋白(vimentin,V)免疫細胞化學染色顯示細胞胞質染成深棕色,為陽性(+);結蛋白(desmin,D)免疫細胞化學染色顯示細胞胞質未染色,為陰性(-);提示本研究從大鼠結腸分離出的細胞具有成纖維細胞的免疫學特征。

2.2 大鼠腸成纖維細胞FN蛋白表達結果

免疫細胞化學染色結果顯示,大鼠 CFB核內及胞質均有FN陽性表達,顏色呈棕黃色。從表2及圖1可見,與正常組比較,模型組CFB的FN蛋白表達明顯增強(P＜0.01);隔藥灸組及西藥組CFB的FN蛋白表達明顯減少(P＜0.01),西藥組與隔藥灸組相比,差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腸成纖維細胞FN表達變化 (±s)

表2 各組大鼠腸成纖維細胞FN表達變化 (±s)

注：與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 陽性積分光密度(IOD)正常組 3 961.709±193.915模型組 3 7307.125±1743.622隔藥灸組1)3 2121.942±329.706西藥組1)2) 3 2257.024±478.7721)2)

圖1 各組大鼠腸成纖維細胞FN免疫細胞化學染色結果[FN染色(×100)]

2.3 各組大鼠腸成纖維細胞CTGF表達結果

大鼠CFB核內及胞質均有CTGF陽性表達,呈棕黃色。從表3及圖2可見,模型組CTGF強表達,與正常組比較明顯增強(P＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組和西藥組CFB的CTGF蛋白表達減少(P＜0.01);西藥組與隔藥灸組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠腸成纖維細胞CTGF表達變化 (±s)

表3 各組大鼠腸成纖維細胞CTGF表達變化 (±s)

注：與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 陽性積分光密度(IOD)正常組 3 1040.599±258.125模型組 3 6446.396±3037.893隔藥灸組1)3 1891.315±165.584西藥組2)3 2125.134±149.0992)

圖2 各組大鼠腸成纖維細胞CTGF免疫細胞化學染色結果[CTGF染色(×100)]

2.4 各組大鼠腸成纖維細胞Smad3、Smad7 mRNA表達結果

Smad3 mRNA檢測結果顯示,正常組為 10.53%± 7.44%,模型組為24.55%±27.08%,隔藥灸組為17.00% ±13.53%,西藥組為16.62%±17.50%。與正常組比較,模型組大鼠CFB的Smad3 mRNA表達雖有增加但差異無統計學意義(P＞0.05);隔藥灸組和西藥組大鼠CFB的Smad3 mRNA表達雖有降低,但差異無統計學意義(P＞0.05)。

Smad7 mRNA檢測結果顯示,正常組為 2.23%± 0.92%,模型組為4.07%±1.32%,隔藥灸組為12.78%± 5.39%,西藥組為 7.27%±5.54%。與正常組比較,模型組大鼠CFB的Smad7 mRNA表達雖有增加但差異無統計學意義(P＞0.05);隔藥灸組和西藥組大鼠 CFB的Smad7 mRNA表達雖有升高,但差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

克羅恩病發病率在世界范圍內呈逐年升高趨勢[18],而腸纖維化是CD進展的主要并發癥之一,被認為是慢性炎癥和傷口愈合失調的結果[19]。在CD腸壁正常修復和纖維化進程中,CFB發揮著重要作用。CD炎癥初期,激活的單核細胞或巨噬細胞等炎性細胞,分泌大量如IL-1β、bFGF、PDGF、TGF-β1和IGF-1等促纖維介質,促使CFB大量出現,是損傷愈合的象征;但反復的炎癥損傷和組織修復不斷刺激腸壁,則使CFB過度增殖并被激活,其產生和分泌ECM的能力增強,導致膠原大量堆積,是腸壁纖維化發生、發展的原因。ECM產生細胞的活化是纖維化形成的關鍵步驟和核心環節,而CFB正是合成和分泌以膠原蛋白為主要成分的ECM的主要來源[20],故CFB被認為是腸壁各層纖維化和狹窄形成的主要細胞類型。CTGF是一種多效細胞因子,有促CFB有絲分裂和趨化的作用,不僅可以直接刺激CFB增殖,還可通過CFB誘導Ⅰ型膠原α1、FN和整合素α5的表達,介導以FN為代表的ECM的沉積,促進間質細胞與Ⅰ型膠原黏著,在結締組織細胞增殖和ECM沉積中扮演著重要作用。CTGF集中在CD腸黏膜下層的CFB內及淋巴結周圍和接近腸腔表面的一些嚴重損傷區域內[21]。CTGF可作用于CFB介導損傷性腸黏膜的修復,而且過度表達的CTGF可刺激CFB增殖和ECM沉積,進而誘發腸纖維化和狹窄的形成。在正常CFB中CTGF通常不表達或極低表達[22],而用TGF-β刺激正常和狹窄性CD的CFB,發現狹窄性CD的腸成纖維細胞CTGF蛋白和mRNA的表達均比正常組高[23],且與腸壁纖維化程度呈正相關,故CFB內CTGF的持續過高表達成為CD腸壁纖維化的基礎。

CTGF是TGF-β特異性下游效應分子,TGF-β的促腸纖維化作用可通過多種信號途徑誘導CTGF的表達來完成[24]。TGF-β刺激CFB增殖和ECM合成,且在正常的成熟CFB中,TGF-β誘導CTGF的表達,在急性纖維化模型中與CTGF協同刺激細胞增殖和ECM沉積。關于CTGF的信號通路,主要與Smad、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)及蛋白激酶C(the protein kinaseC,PKC)的活化有關。在Smad信號通路中,TGF-β誘導CTGF的表達主要依賴Smad3和Smad4,而非Smad2[25];在CTGF啟動子上基因序列為5'-GAGGAATG-3'的Smad結合元件(SBE)是TGF-β誘導CFB分泌CTGF所必需的[22],并為Smad3提供了黏著位點,Smad3可直接與SBE及相關的DNA序列結合,從而促進CTGF的表達。Smad7被認為是TGF-β/Smad信號傳導通路中最重要的負性調節因子之一,可通過抑制Smad3磷酸化來阻滯Smad3/4復合物的形成,進而抑制TGF-β信號通路,Smad7表達下調在纖維化發病機制中起重要作用。

本課題組在體實驗的研究已發現艾灸能夠改善大鼠CD腸纖維化[26],下調CD腸纖維化大鼠結腸TGF-β、Smad4蛋白及mRNA的異常表達[27]。本研究應用細胞培養、免疫細胞化學等技術,在分離培養CFB的基礎上,觀察隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠CFB的CTGF、FN蛋白和Smad3、Smad7 mRNA表達的影響,探討隔藥灸治療克羅恩病腸纖維化的分子機制。研究結果顯示,CD腸纖維化模型大鼠CFB內FN、CTGF蛋白表達顯著增高,隔藥灸治療后,CD腸纖維化大鼠的CFB內FN、CTGF蛋白表達顯著降低,提示下調CFB內FN、CTGF蛋白表達可能是艾灸治療克羅恩病腸纖維化的重要分子機制。對Smad3、Smad7mRNA的檢測結果發現,各組大鼠CFB的Smad3、Smad7mRNA組間比較差異均無統計學意義,分析原因,可能因檢測標本非原代細胞,培養傳代后細胞的原有特性有所改變,無法呈現CFB的在體特征,因而無法檢測出Smad3和Smad7 mRNA表達的變化;抑或是隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠 CFB的 Smad3、Smad7 mRNA表達無影響,而是通過其他途徑影響FN和CTGF蛋白的表達,尚需今后進一步深入探討和驗證。

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Effect of Medicinal Cake Moxibustion on the Expressions of Colonic Fibroblast CTGF, FN and Smad in Crohn Disease Rats with Intestinal Fibrosis

AN Cai-ping1, HUANG Yan2, MA Xiao-peng3, WU Huan-gan3, SHI Zheng3, YANG Ling3, DOU Chuan-zi3.

1.Fudan U niversity O bstetrics & G ynecology H ospital,Shanghai 200001,China; 2.Shanghai U niversity of Traditional C hinese Medicine,Shanghai 201203,China; 3.Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China

ObjectiveTo investigate the effect of medicinal cake moxibustion on the expressions of colonic fibroblast (CFB) CTGF, fibronectin (FN), and Smad3 and Smad7 mRNA in Crohn disease rats with intestinal fibrosis and explore the mechanism of medicinal cake moxibustion treatment for intestinal fibrosis in Crohn disease.MethodSD rats were randomly allocated to normal, model, medicinal cake moxibustion and Western drug groups. After a rat model of Crohn’s disease-associated intestinal fibrosis was made successfully, the medicinal cake moxibustion group was treated by selecting points Tianshu (ST25,bilateral) and Qihai (CV6) and the Western drug group, by oral gavage of mesalazine. After treatment was finished in every group, colonic tissues were taken and rat CBF was separated and cultivated outside the body. The expressions of CTGF and FN in CFB were examined by immunocytochemistry and the expressions of Smad3 and Smad7 mRNA in CFB, by fluorescence-based quantitative real-time PCR in e very g roup of r ats.ResultThe e xpressions of C TGF a nd F N i n C FB i ncreased i n t he model g roup c ompared with t he normal group (both P＜0.01) and decreased in the medicinal cake moxibustion group compared with the model group (both P＜0.01). There were no statistically significant differences in the expressions of Smad3 and Smad7 mRNA in CFB between various groups of rats (all P＞0.05).ConclusionMedicinal cake moxibustion can down-regulate the expressions of colonic fibroblast CTGF and FN in Crohn disease rats with intestinal fibrosis.

Medicinal cake moxibustion; Crohn disease; Fibroblast; CTGF; FN

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.06.0487

1005-0957(2014)06-0487-05

2014-02-20

國家自然科學基金項目(81273843,81072879);國家重點基礎研究發展計劃(2009CB522900);上海高校選拔培養優秀青年教師科研專項基金(SZY10071)

安彩萍(1981 - ),女,住院醫師,碩士

馬曉芃(1973 - ),女,研究員,博士生導師