北極黃河站地區不同基底中真菌的分離培養及初步鑒定

丁慧，王能飛，臧家業，楊曉，冉祥濱，張波濤

（1.青島大學化學科學與工程學院，山東青島 260071；2.國家海洋局第一海洋研究所國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室，山東青島 266061）

北極黃河站地區不同基底中真菌的分離培養及初步鑒定

丁慧1，2，王能飛2*，臧家業2，楊曉1，2，冉祥濱2，張波濤1

（1.青島大學化學科學與工程學院，山東青島 260071；2.國家海洋局第一海洋研究所國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室，山東青島 266061）

為了探索北極陸域真菌的多樣性，進一步揭示其生態學角色，本研究對中國第5次北極科學考察采集自黃河站區附近的24份樣品進行了真菌的分離培養及鑒定，樣品涂布劃線后共分離得到60株真菌，其中腐殖質樣品中分離到的真菌種類和數量最多；對選取的28株代表菌株進行了真菌ITS區序列鑒定，結果表明它們分屬于4個綱，12個屬，分別為散囊菌綱、糞殼菌綱、座囊菌綱和微藻菌綱，其中地絲霉屬為優勢類群。該結果表明北極地區具有豐富的真菌物種多樣性。通過對代表土壤理化性質的測定，探究了真菌多樣性和土壤理化參數的相關性，其中有機碳氮及可溶性營養鹽含量是影響北極土壤真菌多樣性的重要指標。

北極黃河站；真菌多樣性；系統進化分析；土壤理化性質

1 引言

常年低溫，結冰期長，冰水反復凍融，年降水少，強風，強輻射是極地典型的氣候特征。能夠適應這種極端環境的微生物成為極地地區的主要生物類群。極地微生物在長期進化過程中，形成了能適應極端環境的獨特遺傳進化特征和生物代謝途徑［1］。極地微生物資源的開發和利用已經成為國際極端微生物學的熱點之一，研究多集中在極地嗜冷細菌［2］和功能放線菌的開發與利用［3］，而對于極地真菌的研究報道相對較少［4］。

北極區域的微生物多樣性研究主要集中在海水－冰這一生態系統中［5—7］，對冰川和湖泊中的微生物多樣性研究也有報道［8—9］。相比之下，對北極區域土壤微生物的研究較少，對土壤真菌這一特定群落的研究更少。Ma等［10］對格陵蘭GISP2冰芯的中的真菌多樣性做了研究。Gunde-Cimerman等［11］對北極海冰真菌進行了分離純化及多樣性分析。Miteva等［12］對不同冰期（溫和期、冷期、溫暖期）格陵蘭冰芯中的微生物研究證明冰芯中微生物的結構在一定程度上能反映古氣候特征。Singh等［13］調查了斯匹次卑爾根（Spitsbergen）群島的新奧爾松（Ny-?lesund）地區土壤中真菌種類和分布情況，并發現了新菌種。Gawas-Sakhalkar等［14］對北極苔蘚植物及黏附土壤中的真菌分離鑒定，并對其產淀粉酶、纖維素酶果膠酶等的產酶情況做了研究。Wallenstein［15］的研究表明，同細菌群落一樣，北極土壤真菌的群落和多樣性呈現季節性變化。這些研究多集中于各自國家的考察站附近，對于中國北極黃河科考站周圍真菌的系統調查研究不多，只有那廣水等［16］和許丹等［17］對站區附近真菌多樣性及產酶活性的報道。極地地區是全球生態環境最為脆弱的地區，近年來隨著全球氣溫變暖和人類在極地區域活動的增加，對極地生態環境產生了影響，了解北極科考站周圍真菌多樣性，對這些地區的生命活動進行持續的數據積累和系統研究十分必要。

中國北極黃河科學考察站，位于78°55′N、11°56′E的挪威斯匹次卑爾根群島新奧爾松地區王灣西岸。該地區最冷為2月份，平均氣溫約－14℃，最暖7月份，平均氣溫約5℃，年平均氣溫約為－5.8℃，年平均降水量約400 mm。黃河站周圍多苔原和濕地，生長的低等植物主要為苔蘚和地衣，高等植物比較少，如發草及少數廖科植物，是研究高緯度北極微生物的理想場所。本研究利用中國第5次北極科學考察期間采集的樣品為研究對象，系統分析了該地區不同基底中真菌的種類、數量組成等，并結合土壤理化性質對真菌群落菌落多樣性和土壤理化指標的相關性進行了分析，旨在揭示該區域環境中真菌群落的基本特征、分布狀況及物種多樣性等，以期為進一步了解、開發、利用該地區微生物資源和闡明極地真菌生態學意義提供依據。

2 材料與方法

2.1 樣品來源

研究樣品來源于中國第5次北極科學考察所取得的黃河站附近部分樣品，土壤樣品采用無菌鏟取表層大約0～5 cm深度的土樣，裝入無菌密封樣品袋中，低溫條件下運送回國，于4℃低溫冰箱中保存備用，24份樣品具體采樣時間和站位描述見表1。

表1 樣品采集站位Tab.1 Sample collection stations

續表1

2.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：土豆200 g，葡萄糖10 g，瓊脂17 g，去離子水1 000 mL，p H自然，115℃高壓濕熱滅菌30 min，用于涂布和劃線。

2.3 真菌分離純化培養及保種

分別稱取1 g左右樣品，加入到10 mL無菌水中，震蕩混勻后靜置于12℃培養箱中過夜后，將樣品懸液做梯度稀釋，稀釋為10－1、10－2、10－3和10－4。將10－3和10－42個梯度分別取100μL涂布于PDA固體培養基上，每個樣品做3個平行，將平板放于12℃培養箱中倒置培養。培養約1～2周后，待培養基長出真菌菌落，根據菌落形態、所產色素顏色、干燥性等特征，挑取形態差異較大的真菌將其及時轉移至相應的新鮮PDA培養基上劃線分離純化。為了得到純菌落，分離純化步驟至少進行3次，純化后的單菌落，分別在4℃下用相應PDA斜面和－80℃下用25%甘油保種。

2.4 菌株的統計計數及菌落形態觀察

統計計數：平板涂布后，從第7天開始統計每個樣品長出真菌的數目及菌落形態特征做好記錄，直到統計的數目不再發生變化。

菌落形態觀察：將平板劃線純化后的菌株接種在新鮮PDA平板上，于12℃倒置培養1～2周，觀察記錄菌落形態及生長速度，主要包括包括菌落大小（菌落直徑大小、邊緣是否規整）、菌落顏色（培養基正反面顏色，邊緣和中心顏色）、菌落整體隆起形態（絲線狀、樹根狀、絨毛狀、地毯狀等）和菌絲形態（疏松或緊密、放射狀或同心輪紋、裂片狀、有無水珠滲出等）。

2.5 南極真菌系統發育分析

2.5.1 真菌總DNA的提取

將平板劃線純化后的真菌培養一段時間后，用接種環刮取新鮮菌絲約50 mg，于研缽中液氮研磨充分，采用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒（Omega公司），按照使用說明中的操作手冊進行真菌總DNA提取。取5μL總DNA用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取成功的DNA于－20℃冰箱中保存備用。

2.5.2 真菌ITS區PCR擴增

引物序列ITS1∶5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′［18］（引物由上海美吉生物公司合成），對真菌總DNA進行ITS區擴增。PCR擴增體系為50μL∶2×Taq PCR Master Mix（康為世紀）25μL，引物各2 μL，模板DNA 5μL，重蒸水16μL。擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸10 min；取5μL PCR擴增產物經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4℃保存，之后統一送至中科院海洋所測序。

2.5.3 系統發育樹的構建

將測序后的真菌ITS r DNA序列登錄GenBank數據庫進行Blast對比，與NCBI上已有序列進行相似性比較分析，選取與實驗菌株同源性相近的菌株用BioEdit軟件的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment）進行序列比對，采用Mega5.1軟件的鄰接法（neighbor-joining method）進行系統發育分析并構建系統發育樹。

2.6 土壤理化性質分析

選取有代表性的4份樣品，對基本的土壤理化性質：含水率、p H、有機碳、有機氮、可溶出性營養鹽（硅鹽、磷鹽、氮鹽）進行測定。其中土壤含水率的測定用烘干法；p H測定參照國標（NY／T 1377－2007）采用電位法用酸度計測定（水土比為2.5∶1）；有機碳氮含量的測定采用元素分析儀（EA3000）；可溶性營養鹽的測定（水土比為5∶1）采用全自動連續流動分析儀（Qu AAtro）。每個樣品重復3次，測量結果取平均值［19］。

3 結果

3.1 菌株的分離純化與形態觀察

通過涂布及平板劃線培養，從24份樣品中共分離獲得60株真菌，由肉眼觀察培養基中菌落形態可知分離出的北極真菌表面形態不一，主要有絨毛狀，同心輪狀，棉絮狀，還有的呈現發射狀；菌落的顏色多樣，有白色、黑色、棕色等；部分菌落在生長后期菌體形成孢子層滲出水珠，代表菌落的形態見圖1所示。

不同基底分離得到的真菌數目和形態特征見表2，根據菌落形態觀察，從每份樣品中選取形態顏色大小等特征差異較為明顯的真菌做進一步進行分子鑒定，總計測序28株真菌。

表2 樣品中分離出的真菌數量及種類Tab.2 The number and species of fungi from different samples

圖1 部分代表真菌菌株的菌落形態Fig.1 Morphological character of representative isolated fungal strains

3.2 基因序列測定及系統進化分析

通過進行ITS rDNA的PCR反應，擴增出的基因平均片段大約為650 bp，將這28株真菌的ITS rDNA序列測序結果登錄到GenBank數據庫進行Blast對比，與NCBI上已有序列進行相似性比較分析，選取同源性最近的菌株用于系統進化樹的構建，系統進化樹如圖2所示。

3.3 土壤理化性質測定結果

選取有代表性的4份樣品，對基本的土壤理化性質：含水率、p H、有機碳、有機氮、可溶出性營養鹽（硅鹽、磷鹽、氮鹽）進行了測定，結果如表4所示，從表中數據可知，各項理化性質指標存在一定程度的差異。土壤含水率基本都在10%～20%之間，只有S島蓼科根際土的含水率比較高為59.96%；p H酸堿性不一，在6.5～8.5之間波動；有機碳氮的含量大都比較低，其中S島蓼科根際土的含量相對其他樣品要高出許多；可溶出態營養鹽含量也比較少。總體而言，該地區土壤中營養成分比較貧瘠。

表4 不同地區樣品理化性質Tab.4 Basic physicochemical properties of samples at different sites

圖2 根據真菌ITS基因序列構建菌株系統進化樹。進化距離的計算采用Kimura雙參數計算模型；樹的拓撲形狀采用neighbour-joining方法構建；分枝上的數字為1 000次bootstrap分析所得的值；線段0.05代表0.05進化距離；括號內數字為序列的登錄號；粗體字為本研究中得到的序列Fig.2 Phylogenetic trees of fungi ITS sequences.The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighbourjoining analyses of 1000 data sets，brackets are GenBan K accession number

4 討論

北極不同基質所處的生態環境大都不同，導致真菌的數目和種類也有所差異。本研究對北極黃河站區附近的不同基底采樣點的真菌進行了分離培養，對菌落在固體培養基上的形態進行了描述，并根據ITS區基因序列對菌株進行了分子生物學鑒定。本研究結果表明，北極不同基質中大部分都有可培養真菌的分布，北極地區的真菌已經適應了當地殘酷的生存環境。

新奧爾松地區氣候季節性差異比較大，周圍多苔原和濕地，生長的動植物種類比較簡單，是研究高緯度北極微生物的理想場所，法國、印度、英國等國家都在此建立考察站。現有的對北極真菌的報道，Singh等［13］從斯匹次卑爾根群島的新奧爾松地區土壤中分離出30株真菌，研究顯示真菌的數量0.5×104～2.0×105g－1。通過形態學分類及序列分析鑒定為18個屬的19個物種，被孢霉屬Mortierella占主導地位，其中4株為首次分離自北極土壤的真菌。Gawas-Sakhalkar和Singh［14］從北極苔蘚植物及粘附土壤中分離出46株微真菌，分屬于12個屬的20個種，其中7株為新發現的種，并對其產淀粉酶、纖維素酶、果膠酶等的產酶情況做了研究。許丹等［17］采用多種培養基對新奧爾松地區土壤的真菌進行分離純化，獲得真菌65株，18S rDNA序列的系統發育多樣性表明，65株真菌多樣性較高，分屬25個屬，其中數量上最多的是青霉屬Penicillium，其次為叢赤殼屬Nectria和節枝孢屬Articulospora，并篩選出β－葡萄糖苷酶活性菌株28株。那廣水等［16］從北極黃河站2006年考察采集土壤樣本中共分離出14株真菌，對菌株進行了抗菌、抗腫瘤活性菌株的篩選，但是未對其進行種屬鑒定。上述研究報道表明，北極地區具有較高的真菌多樣性，并且菌株具有潛在多種酶活表現。

本研究從24份不同基質的樣品中共分離培養得到60株真菌，通過ITS rDNA序列分析表明它們分屬于4個綱，12個屬，分別為散囊菌綱、糞殼菌綱、座囊菌綱和微藻菌綱。結果顯示該地區的優勢類群為地絲霉屬Geomyces，共23株，占菌株總數目的38.33%，分布于12個站位；其次為被孢霉屬Mortierella，共15株，占菌株總數目的25.00%，分布于5個站位，本研究的結果和上述文獻存在一定的差異，這可能與采樣地點、培養方法等不同有關，但是主要的真菌類群基本是一致的。本研究豐富了對黃河站附近地區陸域真菌多樣性和優勢菌群的認識。

此外，對南北極的微生物研究中，有研究者發現兩極地區有許多相同或者相近的微生物資源［20］。我們的實驗發現，許多經測序的代表真菌菌株與來源于南極土壤中的參比菌株具有很高的相似性，有的可達100%，也在一定程度上論證了南北極微生物的部分同源性。

土壤理化性質的差異會影響微生物群落的多樣性，文章通過對代表樣品的主要土壤理化性質的測定，結合不同樣品中真菌分布的種類和數目來分析真菌多樣性和土壤理化指標的相關性。測定結果表明各項理化性質指標對真菌的多樣性都有一定程度的影響，在土壤p H接近中性的條件下，有機碳氮及可溶性營養鹽含量越高，可培養性真菌的分布越廣。對于土壤理化性質與整個微生物群落多樣性的相關性還需要結合不依賴培養的分子生物學方法如高通量測序技術進行深入分析。

在極地地區，真菌是重要的初級生產者之一，在生態系統中發揮著重要的作用。相對于極地陸域細菌，目前對于極地真菌的研究較少，本文對中國北極黃河站附近24個站位的樣品中可培養真菌的多樣性以及典型代表土壤理化性質做了初步探究，為進一步了解該地區的微生物多樣性以及深入探求土壤理化指標對生物多樣性的響應機理提供了參考。

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Isolation and preliminary identification of fungi in different substrate from the Arctic Yellow River Station

Ding Hui1，2，Wang Nengfei2，Zang Jiaye2，Yang Xiao1，2，Ran Xiangbin2，Zhang Botao1

（1.College of Chemical Science and Engineering，Qingdao University，Qingdao 266071，China；2.Key Lab of Marine Bioactive Substances State Oceanic Administration，First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China）

In order to explore the diversity of fungi in the Arctic land and reveal their ecological roles，fungi were isolated and identified from 24 samples collected from Yellow River Station during the 5thChinese Artic Scientific Expedition in the present study.Sixty strains of fungi were totally isolated by plate spreading and streaking.More fungal species and quantity were isolated in humus than in other samples.Classification and phylogenetic analysis based on ITS rDNA showed that 28 representative fungal strains belonged to 4 classes，including Eurotiomycetes，Sordariomycetes，Dothideomycetes and Phycomycetes，and 12 genus.Geomyces was one of the most dominant genera among them.The data indicated that abundant fungal diversity existed in Arctic.The relationship between physicochemical parameters of soil and fungal diversity was explored through determination of physical and chemical properties of the representative soil.The organic carbon and nitrogen and soluble nutrient content areimportant factors affecting the fungal diversity in Arctic.

Arctic Yellow River Station；fungal diversity；phylogenetic analysis；physicochemical

Q939

A

0253-4193（2014）10-0124-07

2013年全球海洋學SCI期刊引證指標

2013 Articles ANNU REV MAR SCI 1941－1405 1 628 16.381 16.277 2 Abbreviated Journal Title ISSN 2013 Total Cites Impact Factor 5-Year Impact Factor 4 OCEANOGR MAR BIOL 0078－3218 2 180 11.083 10.194 5 PROG OCEANOGR 0079－6611 5 899 3.986 4.713 115 PALEOCEANOGRAPHY 0883－8305 6 793 3.918 4.177 60 LIMNOL OCEANOGR 0024－3590 25 146 3.615 4.332 177 OCEANOGRAPH Y 1042－8275 2 337 3.285 3.779 56 MAR CHEM 0304－4203 8 111 3.2 3.85 97 J PHYS OCEANOGR 0022－3670 11 935 2.871 3.132 169 DEEP-SEA RES PT I 0967－0637 6 581 2.825 3.198 119 DEEP-SEA RES PT II 0967－0645 7 542 2.763 2.989 226 MAR ECOL PROG SER 0171－8630 34 992 2.64 3.17 500 OCEAN MODEL 1463－5003 2 305 2.59 2.988 106 FISH OCEANOGR 1054－6006 1 873 2.542 2.795 39 ICES J MAR SCI 1054－3139 7 533 2.525 2.595 140 TELLUS A 0280－6495 2 382 2.518 2.609 58 J MARINE SYST 0924－7963 4 965 2.476 2.769 136 J PLANKTON RES 0142－7873 6 060 2.263 2.419 108 ESTUAR COAST SHELF S 0272－7714 12 625 2.253 2.782 295 MAR FRESHWATER RES 1323－1650 4 027 2.25 2.191 105 MAR GEOL 0025－3227 9 584 2.201 2.586 153 CONT SHELF RES 0278－4343 7 161 2.115 2.491 246 GEO-MAR LETT 0276－0460 1 340 2.062 2.113 40 OCEAN SCI 1812－0784 883 1.962 2.209 68 J SEA RES 1385－1101 2 277 1.855 2.318 129 OCEAN COAST MANAGE 0964－5691 2 269 1.769 2.029 233 POLAR RES 0800－0395 1 081 1.686 1.966 46 OCEAN DYNAM 1616－7341 1 485 1.683 1.867 79 LIMNOL OCEANOGR-METH 1541－5856 1 499 1.681 2.551 54 DYNAM ATMOS OCEANS 0377－0265 7 63 1.581 2.358 19 J OPER OCEANOGR 1755－876X 62 1.5 1.17 8 J OCEANOGR 0916－8370 1 992 1.464 1.701 55 HELGOLAND MAR RES 1438－387X 1 486 1.408 1.688 63 OCEAN ENG 0029－8018 3 200 1.337 1.615 316 B MAR SCI 0007－4977 4 411 1.333 1.494 53 IEEE J OCEANIC ENG 0364－9059 2 228 1.325 1.524 64 APPL OCEAN RES 0141－1187 988 1.262 1.333 81 THALASSAS 0212－5919 114 1.226 0.875 12 ATMOS OCEAN 0705－5900 949 1.19 1.34 37 ENVIRON FLUID MECH 1567－7419 522 1.164 1.775 31 MAR GEOD 0149－0419 639 1.115 1.757 24 TERR ATMOS OCEAN SCI 1017－0839 804 1.061 0.957 85 OCEANOLOGIA 0078－3234 482 0.927 1.046 47 OCEANOL H YDROBIOL ST 1730－413X 349 0.867 0.698 55 MAR GEOPHYS RES 0025－3235 689 0.763 0.966 28 MAR TECHNOL SOC J 0025－3324 506 0.757 0.827 64 J NAVIGATION 0373－4633 595 0.691 0.813 54 ACTA OCEANOL SIN 0253－505X 868 0.684 0.762 138 CHIN J OCEANOL LIMN 0254－4059 720 0.684 0.715 145 NEW ZEAL J MAR FRESH 0028－8330 1 887 0.678 1.091 38 AUST METEOROL OCEAN 1836－716X 212 0.63 1.256 22 IZV ATMOS OCEAN PHY＋0001－4338 702 0.597 0.749 101 BRAZ J OCEANOGR 1679－8759 313 0.534 0.85 28 OCEANOLOGY＋0001－4370 805 0.487 0.516 70 REV BIOL MAR OCEANOG 0717－3326 349 0.469 0.658 64 MAR GEORESOUR GEOTEC 1064－119X 153 0.383 0.46 22 J OCEAN U CHINA 1672－5182 356 0.381 80 INDIAN J GEO-MAR SCI 0379－5136 60 0.313 0.324 131 NAV ENG J 0028－1425 130 0.084 0.163 38

2014-02-10；

2014-04-26。

南北極環境綜合考察與評估專項（CHINARE－2013－02－01，CHINARE－2013－01－06，CHINARE－2013－04－01－07）。

丁慧（1991—），女，山東省膠南市人，主要從事微生物制藥研究。E-mail：dinghui4321＠126.com

*通信作者：王能飛。E-mail：wangnengfei＠fio.org.cn

丁慧，王能飛，臧家業，等.北極黃河站地區不同基底中真菌的分離培養及初步鑒定［J］.海洋學報，2014，36（10）：124—130，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.10.013

Ding Hui，Wang Nengfei，Zang Jiaye，et al.Isolation and preliminary identification of fungi in different substrate from the Arctic Yellow River Station［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（10）：124—130，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.10.013