褪黑素與“脾應長夏”理論的關系及機理初探?

梁紅娟,常瑞華,季新燕,王穎莉,王 燕,孫偉衛,曹慧慧,馮前進,劉亞明,李俊蓮

(山西中醫學院,太原 030024)

光-褪黑素(melatonin，MT)生物信號傳導周期理論是一個很前沿的生物研究領域，MT的產生及晝夜分泌周期變化與外界日光照射存在著同步振蕩協調的關系，且MT分泌的季節性變化與自然界氣候變化同樣存在同步振蕩的關系[1]。一年中的冬季、早春、晚春、夏季、早秋、深秋測定山羊血清MT，早春和晚春、早秋和深秋的MT分泌水平也不一致[2]。這個理論為中醫“天人相應”、“五臟應時”理論現代研究提出了一種鏈接的契合點。“脾應長夏”作為中醫“五臟應時”理論的一個重要組成部分，認為人體五臟中“脾”的相關生命活動與長夏季節產生同步的協調變化，此時五臟由脾當令、由脾所主。如《靈樞·五音五味論》曰：“足太陰，臟脾，色黃，味甘，時季夏。”季夏為夏季最后1個月即長夏。課題組前期在MT與“心應夏”關系的研究中發現，MT與心鈉素之間存在著一定的相關性[3]。本實驗從MT隨季節變化的角度出發，探討內源性MT與長夏季節脾臟生理、病理模型的主要分子——胃泌素(gastrin，GAS)、胃動素(motilin，MTL)之間的關系，將取材點設為長夏正中之大暑當日，以便于更好地反映長夏季節的氣候變化特點，為“脾應長夏”理論的現代研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，體質量(180±20)g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物中心(合格證號SCXK(京)2009-0017)。

1.2 藥物與試劑

大黃飲片(購自北京同仁堂藥店，由亳州市京皖中藥飲片廠生產，批號120201)，大鼠MT(批號E30014)、大鼠GAS(批號E30675)、大鼠MTL(批號E30375)的ELISA試劑盒(由美國R&D公司生產)，酚紅(由天津市光復精細化工研究所生產，批號20111204)、氫氧化鈉(由天津市天大化工實驗廠生產，批號20110616)、羧甲基纖維素鈉(由天津市光復精細化工研究所生產，批號20110920)等。

大黃水煎液制備方法：將大黃飲片浸泡20 min水煎，待沸后15 min，煎液3層紗布過濾，二煎煎沸15 min，過濾法同上，合并2次煎液，于旋轉蒸發儀上濃縮成1 g/L水煎液，分裝在小瓶中，4℃保存，室溫下灌胃用。

1.3 主要儀器

KDC-1044低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，IKA-T25勻漿機(德國)，SPECTRAMAX 190全波長酶標儀(美國MD公司)，GZX-9076 MBE 電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，721型可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組

將SD大鼠分成正常對照組、松果腺摘除手術組(手術組)、松果腺偽摘除手術組(假手術組)和脾氣虛組共4組。每組10只，雌雄各半，自由取食飲水，適應性飼養1周(飼料為普通鼠全價顆粒飼料，購自山西醫科大學實驗動物中心)。

2.2 造模

正常對照組大鼠自由取食和飲水，不施加任何處理因素；手術組大鼠于大暑前30 d行松果腺摘除術[3,4]；假手術組大鼠于大暑前30 d行偽手術[3,4]；脾氣虛組大鼠于大暑前21 d開始脾氣虛模型復制[5]，造模以大黃法、游泳力竭法、饑餓法3種因素復合進行，每日上午以20 g/(kg·d)劑量灌服1 kg/L大黃水煎液，每日下午將動物負重(于大鼠尾根部纏繞質量為該大鼠體質量10%的鐵絲)放入水深40 cm、水溫20℃的水槽中游泳，以力竭為度(大鼠鼻尖沒入水面10 s)，同時每日早8∶00給食、晚8∶00撤食。

2.3 標本采集

各組大鼠術前禁食12 h稱重，每只大鼠用0.04%酚紅糊(含l0%羧甲基纖維素鈉)按照2 ml/只的量灌胃，20 min后乙醚麻醉后用毛細波管取眼眶血3 ml～5 ml，3000 r/min離心10 min，收集并分裝血清和血漿，-70℃冰箱存放待檢；后深麻醉處死動物，迅速開腹，結扎胃賁門和幽門，取胃置于15 ml的冷生理鹽水中，沿胃大彎剪開，充分清洗胃內容物，取洗液5 ml，3000 r/min離心10 min，吸取3 ml加入1 mol/LNaOH溶液0.5 ml中，吸上清液用分光光度計于560 nm波長處比色，測其吸光度(A)，即為胃酚紅A值，測0.04%酚紅2 ml+生理鹽水15 ml+1 mol/LNaOH0.5 ml溶液的A，即為基數酚紅A值；取出小腸輕輕剝離后將其平鋪于白紙上，測量幽門至酚紅前沿的距離及幽門回盲部的小腸全長。

2.4 指標檢測

2.4.1 各組大鼠體質量及脾氣虛組大鼠游泳時間的測定 正常組、手術組、假手術組每周檢測大鼠體質量，脾氣虛組從造模第 1 天起，每日在灌胃前檢測大鼠體質量，游泳時記錄游泳時間。并隨時觀察泄瀉、納呆、形瘦、行動遲緩、被毛散亂豎起等情況變化，及時記錄在已制定的觀察表格中。

2.4.2 胃排空及小腸推進速度測定[6]以胃酚紅殘留率(胃酚紅殘留率=A胃酚紅/A基數酚紅×100% )評價胃排空速度；以小腸推進百分率(小腸推進百分率=移行距離/小腸全長×100%)評價小腸推進速度。

2.4.3 血清MT、血清GAS 及血漿MTL的檢測 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測其血清MT、血清GAS和血漿MTL的含量，具體操作參照試劑盒說明書。

2.5 統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，樣本前后的變化采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，均數間的多組比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

正常對照組大鼠在整個實驗過程中精神良好，反應敏捷，行動有力，攝食正常，大便成形，被毛光澤緊密，體肌健壯。手術組與假手術組大鼠因手術原因，1周之內精神安靜，反應遲緩，被毛光澤豎起，飲食基本正常，大便成形。1周后傷口愈合，精神變好，反應靈敏，行動有力，攝食正常，大便成形，被毛光亮緊密，體肌健壯。脾氣虛組大鼠在造模前4 d其行為狀態、活躍程度、情緒反應、皮膚毛發、飲食睡眠與大便狀態等均未出現明顯變化；第5天開始多數大鼠開始泄瀉，多為便溏、肛周污穢，逐漸出現厭食、閉眼、畏寒、反應遲鈍、皮毛不澤甚至枯槁，并有毛發疏散、豎立、體質量不增；第15天出現行動變緩，成群蜷縮，飲食減少，皮毛不順，羸弱，游泳時間顯著變短。

3.2 大鼠體質量變化及脾氣虛組大鼠游泳時間變化

表1顯示，與正常對照組比較，脾氣虛組大鼠體質量明顯下降(P<0.01)，第30天的體質量明顯低于造模前體質量(P<0.01)，游泳時間也明顯短于造模前游泳時間(P<0.01)，而手術組與假手術組體質量與對照組之間無明顯差異。

表1 各組大鼠體質量的變化及脾氣虛組大鼠游泳時間的變化(±s)

表1 各組大鼠體質量的變化及脾氣虛組大鼠游泳時間的變化(±s)

組別例數第7天平均體質量(g/只)第30天平均體質量(g/只)第7天平均游泳時間(s/只)第30天平均游泳時間(s/只)正常對照組10229.50±24.39268.40±32.81 手術組10220.90±11.91270.10±40.36假手術組10220.20±11.96269.60±32.98脾氣虛組10223.50±20.78186.80±27.09**△△8.70±6.222.80±3.51△△

注：與正常對照組比較：**P<0.01；與脾氣虛組第7天比較：△△P<0.01

3.3 大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進率、血清MT、血清GAS及血漿MTL的變化

表2顯示，與正常對照組比較，脾氣虛組大鼠胃酚紅殘留率高及小腸推進率降低(P<0.05)，血清MT(P<0.01)、血清GAS(P<0.01)及血漿MTL(P<0.01)的含量明顯減小，說明脾氣虛大鼠胃腸運動功能減弱，大鼠脾氣虛能使血清MT、血清GAS及血漿MTL分泌減少；假手術組大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進率、血清MT、血清GAS及血漿MTL均無明顯差異，說明開顱術對胃腸運動功能、血清MT、血清GAS及血漿MTL的產生均無明顯影響；手術組胃酚紅殘留率高及小腸推進率降低(P<0.05)，血清MT(P<0.01)、血清GAS(P<0.01)及血漿MTL(P<0.05)的含量減小，說明摘除大鼠松果腺后導致大鼠胃腸運動減弱，大鼠血清中MT、GAS及血漿中MLT的含量明顯下降。與手術組比較，脾氣虛組大鼠血清GAS的含量明顯減小(P<0.05)，說明大鼠經造模后，胃腸道功能明顯下降，對GAS的分泌產生了顯著影響。與假手術組比較，手術組大鼠胃酚紅殘留率高及小腸推進率降低(P<0.05)，血清MT、血清GAS及血漿MTL的含量均減小(P<0.05)，說明松果腺摘除后可致大鼠胃腸運動減弱，大鼠血清中MT、GAS及血漿中MLT的含量下降。

表2 各組大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進率、血清MT、血清GAS及血漿MTL的含量變化(±s)

表2 各組大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進率、血清MT、血清GAS及血漿MTL的含量變化(±s)

組別例數胃酚紅殘留率(%)小腸推進百分率(%)MT(ng/L)GAS(ng/L)MTL(ng/L)正常對照組1051.20±21.6289.48±6.4342.09±3.50236.54±3.45267.61±5.61手術組1084.71±17.31*△83.39±5.52*△34.38±3.37**△235.69±2.19**△261.23±5.12*△假手術組1061.24±28.7789.77±6.9439.08±4.46236.68±2.93268.83±7.75脾氣虛組1080.65±16.20*81.47±6.21*33.60±2.93**232.77±3.26**#260.30±4.03**

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較：△P<0.05；與手術組比較：#P<0.05

4 討論

中醫學認為，脾主運化，主升清，主四肢，為后天之本，氣血生化之源。脾氣虛弱，無力消化飲食水谷轉化成水谷精微，不能轉輸到全身各臟腑，導致各臟腑器官失去濡養而出現全身消瘦、乏力、泄瀉等癥狀。本實驗采用3種復合方法建立脾氣虛模型，運用飲食不節、攻下、過度游泳的手段使大鼠處于后天失養、泄瀉、過度勞累的狀態，最終使脾氣受損。該方法與中醫學脾氣虛的病因基本一致。從實驗中看到，脾氣虛組大鼠體質量明顯下降，游泳時間顯著縮短，出現納差、泄瀉、蜷縮、毛發無澤等一系列癥狀，其胃排空速度延緩，小腸推進速度減慢，MTL和GAS分泌量下降，說明脾氣虛模型建立成功。與以往文獻報道結果一致[7,8]。

MT是由腦內松果腺分泌的神經內分泌激素，具有晝夜、季節性變化規律[9]。有學者經多年研究[10]認為，松果腺是五臟調控與五季關系的中介；松果腺隨著季節變化而分泌不同含量的MT，可能是中醫學五臟與五時相通應的主要調節點，是五臟調控機制的控制器。松果腺和其分泌的MT對雄性大鼠的腸道動力系統可產生一定的影響，具體作用機制尚待研究[11]。外源性MT可因劑量不同對胃腸運動起到雙向調節的作用[12]。從本實驗結果分析，MT含量與胃腸運動功能、MTL、GAS的含量存在一定的聯系，這種聯系表現為正相關，正常大鼠與脾氣虛大鼠在長夏季節大暑當天分泌的MT與松果腺腺體分泌的MT具有一致性，可以推測脾氣虛組血清GAS和血漿MTL的減少和胃腸運動功能的降低與大鼠血清MT的減少有關。摘除松果腺的手術組血清MT的減少可能引起GAS、MTL分泌減少和胃腸運動功能降低，即長夏季節，MT可能參與調控脾臟的生理功能，保護胃腸道的正常運動和GAS、MLT 2種胃腸道激素的正常分泌，抑或脾在長夏的功能正常與否關系著GAS、MTL的分泌及胃腸正常運動的發揮。GAS、MTL可能參與MT對胃腸道系統的調控過程，是光-MT信號調節消化系統活動的有關分子之一。

GAS、MTL均是腦腸肽，不僅分布在胃腸道中，也分布在中樞神經中。GAS可刺激胃酸、胃蛋白酶、促胰液素、胰酶等分泌，增強胃腸道的運動和胃黏膜的生長。MTL對消化間期的復合運動與胃腸道的運動、分泌都有強烈的作用。研究發現，中樞MTL對胃腸的作用是通過一種非腎上腺素非膽堿能神經元完成的，而迷走神經是其信號下傳的通路[13]。由此推測，MT下降可能引起中樞神經沖動抑制，阻斷胃腸激素信號在下丘腦-延髓-迷走神經的傳導，非膽堿能非腎上腺素能神經元最終不能在胃腸道形成沖動，GAS、MLT的含量下降，從而導致胃腸平滑肌松弛、張力及蠕動減弱，胃排空時間延長，小腸運動減弱，胃腸運動異常，消化功能低下。

綜上所述，MT與“脾應長夏”理論存在著一定相關性，MT與GAS、MTL之間存在正相關，正常大鼠與脾氣虛大鼠在長夏季節大暑當天分泌的MT與松果腺腺體分泌MT具有一致性，說明MT分泌的季節性變化與自然界氣候的變化存在一個同步振蕩的關系[1]。這也是中醫“天人相應”、“五臟應時”理論的物質基礎。外周神經中的GAS、MTL含量與中樞神經中同一物質的作用機制及信號傳導途徑需要進一步研究。本實驗認為，松果腺分泌的MT以及血清GAS、血漿MTL可作為“五臟應時”理論研究中的信號分子。

參考文獻：

[1] 馮前進,劉亞明,郭霞珍,等.從天人相應到光-MT生物信號轉導周期網絡：一個關于生命衰老動因的統一理論——補腎方藥(杞蓉益精顆粒)對小鼠光-MT生物信號轉導周期調諧作用的實驗研究[J].山西中醫學院學報,2005,6(1):1-10.

[2] Aino Alila-Johansson, Lea Eriksson, Timo Soveri, et al. Seasonal variation in endogenous serum melatonin profiles in goats: a difference between spring and fall?[J].Bio Rhythms, 2001, 16(3): 254-263.

[3] 常瑞華,梁紅娟,王艷,等.心應夏理論與褪黑素關系初探[J].遼寧中醫雜志,2013,40(7):1353-1356.

[4] 馬淑然,趙樹宏,肖延齡,等.中醫“肺應秋”調控機制與褪黑素受體關系的研究[J].中華中醫藥雜志,2011,26(1):65-68.

[5] 鄭小偉,王穎,宋紅.三種脾氣虛證模型大鼠血清胃泌素及胃竇G細胞的比較研究[J].中華中醫藥雜志,2006,21(6):338-340.

[6] 徐偉,孫維峰,梁靜,等.升降方對應激大鼠胃排空及胃腸激素的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(23):171-173.

[7] 王洪海,謝鳴.復合因素致脾虛證模型大鼠血中胃腸激素含量的變化[J].中國實驗方劑學雜志,2006,12(10):31-35.

[8] 任平,黃熙,李月彩,等.脾虛證大鼠組織和血漿中SS、CCK、MOT含量的變化[J].世界華人消化雜志,2000,8(4):436-438.

[9] 常瑞華,季新燕,馮文全,等.褪黑素與中醫天人相應理論的作用靶點評述[J].山西中醫學院學報,2011,12(3):70-72.

[10] 許筱穎,郭霞珍,劉曉燕,等.AANAT-褪黑素-松果腺在中醫五臟調控理論中的作用[J].北京中醫藥大學學報,2009,10(32):657,658,662.

[11] Aydin M,Canpolat S,Kuloglu T,et al．Effects of pinealectomy and exogenous melatonin on ghrelin and peptide YY in gastrointestinal system and neuropeptide Y in hypothalamic arcuate nucleus: Immunohistochemical studies in male rats[J].Regul Pept,2008,146(1-3): 197-203.

[12] 陳春球,丁衛星,李永渝.褪黑素對胃腸運動的影響[J].中國病理生理雜志,2011,27(11):2185-2188.

[13] 王韶軒.腦腸肽與消化及神經系統基礎與臨床[M].濟南:山東大學出版社,2010:161.