中藥超微粉腧穴敷貼對變應性鼻炎大鼠TGF-β1和IL-17含量影響的研究?

陳 靜，陳俊琦，黃 泳，張嘉玲，唐純志

(1.南方醫科大學中醫藥學院針灸推拿教研室，廣州 510515; 2.南方醫科大學第三附屬醫院康復醫學科，廣州 515630;3.廣州中醫藥大學針灸推拿學院，廣州 510405)

變應性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)又稱過敏性鼻炎，是變應原激發由IgE介導的I型變態反應性疾病。一般認為，是Th1/Th2免疫反應失衡或免疫細胞向Th2細胞過度分化及鼻黏膜的高反應性引起的。但新的研究顯示，CD4+T淋巴細胞應該分為Th1、Th2、Treg和Th17四大亞群[1,2]。

Treg細胞屬于調節性T細胞(Thr)亞型之一，具有免疫抑制調節功能，主要分泌TGF-β1細胞因子。Th17主要介導炎癥反應，研究表明IL-17與變應性炎性反應有重要的相關性[3～5]，其分泌的主要效應因子為白細胞介素17(Interleukin 17，IL-17)。調節性T細胞(Treg)和Th17細胞的發現以及相互間的關系，在更高層面為解釋變應性鼻炎的發生提供了依據[6]。

腧穴敷貼法是在傳統針灸醫學基礎上應用中藥作用于腧穴，通過經絡對機體的調整作用而達到預防和治療疾病的一種中醫外治法[7]。臨床上被廣泛應用于呼吸系統疾病的治療，如慢性支氣管炎、哮喘、變應性鼻炎等，并收到良好的臨床療效。本實驗旨在觀察中藥超微粉腧穴敷貼對AR大鼠血清TGF-β1和IL-17含量的影響，以探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

2月齡50只SD大鼠，雌雄各半(購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號0074460)，飼養于廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，分籠置于室溫18～22℃，12 h間斷照明，自由進食水。按隨機數字表法將實驗動物分成正常對照組10只(雄5雌5)和造模組40只(雄20雌20)2組。動物適應性喂養3 d后進行造模，將造模成功的AD模型大鼠再隨機分為即空白模型組(A組)、丙酸氟替卡松組(B組)、普通粉組(C組)和超微粉組(D組)4組，每組10只。

1.2 實驗試劑

卵清蛋白(OVA，Sigma Chemical Co. P.O)；氫氧化鋁Al(OH)3粉佐劑(天津市市福晨化學試劑廠)；Rat TGF-β1 ELISA Kit、Rat IL-17 ELISA Kit (武漢博士德生物工程公司)；丙酸氟替卡松(輔舒良)鼻噴霧劑(英國葛蘭素史克有限公司)。

1.3 中藥腧穴敷貼劑

普通粉(組成：白芥子粉、延胡索粉、細辛粉、甘遂粉)，批號080710，購于廣州致信中藥飲片有限公司；超微粉成分同普通粉，由廣東省第二中醫院藥劑科粉碎成粒徑范圍0.1～75 μm，粒度分布中心D50≈10～15 μm，達300目以上的超微粉。所有中藥均經過南方醫科大學中藥制劑教研室鑒定，藥粉敷貼前均混合新鮮姜汁并調和均勻。

1.4 取穴

大鼠大椎、肺俞、腎俞定位參考《常用實驗動物穴位定位》。大椎位于第7頸椎與第1胸椎間、背部正中，肺俞位于第3胸椎下兩旁肋間，腎俞位于第2腰椎下兩旁。

1.5 實驗方法

1.5.1 模型制備 卵清蛋白(OVA)10 mg + Al(OH)3粉末30 mg + 生理鹽水1ml制成混懸液，對造模組大鼠行腹腔內注射，隔日1次共7次，作為基礎致敏。第15天進行加強免疫，給予5%OVA 50u1滴鼻/(側/d)和1%OVA噴霧吸入5 min，連續7 d。正常對照組大鼠給予等量生理鹽水代替進行腹腔注射、滴鼻及噴霧吸入刺激(方法同上)。

1.5.2 行為學計分 分別與治療前后進行激發后30 min觀察并記錄大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為。計數噴嚏個數：1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分；鼻涕留至鼻孔處為1分，過鼻孔為2分，流涕滿面為3分；鼻癢輕擦鼻1～2次為1分，抓撓鼻、面不止，到處擦摩為2分。以上各項指標均采用疊加量化記分法，總分5分表示造模成功。經評定，造模組所有大鼠評分均超過5分，顯示本組大鼠全部造模成功。

1.5.3 治療方法 丙酸氟替卡松組(B組)：給予丙酸氟替卡松氣霧劑噴鼻，每日1次，每次50 μg，連用10 d。普通粉組(C組)首先進行備皮，用眼科剪沿穴位周圍剪毛，縱向范圍是大椎至腎俞，橫向范圍是脊柱兩側各旁開1.5 cm。將按比例配置好的普通粉與新鮮姜汁調和均勻，制成0.5 cm×0.5 cm大小的藥塊，用3 cm×3 cm一次性紙膠布固定于穴位，再使用一次性透氣孔膠布纏繞一圈以加固藥貼。每次貼藥4 h，連續10 d。超微粉組(D組)采用超微粉敷貼，方法同普通粉組。空白模型組(A組)給予生理鹽水滴鼻，每日1次，連用10 d。正常對照組不采取任何處理措施。

1.5.4 外周血TGF-β1、IL-17水平檢測 摘眼球法取大鼠外周血，將血液靜置2 h，離心取上清液。根據酶標儀檢測結果得到樣品的吸光值，利用標準曲線的方程式計算得出待檢樣品中TGF-β1、IL-17的濃度(ng/ml)，稀釋標準為1∶99。根據ELISA試劑盒說明書操作，按照標準曲線計算標本所測濃度。

1.5.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，血清TGF-β1、IL-17采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血清TGF-β1的表達

表1顯示，TGF-β1多重分析結果顯示，A組血清TGF-β1含量較正常對照組大幅升高，提示造模成功；D組血清TGF-β1含量較A組、B組、C組顯著下降(P<0.05)，與正常對照組比較差異有統計學意義(P=0.05)；B組血清TGF-β1含量較A組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；C組血清TGF-β1含量較A組下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而B與C組之間比較差異無統計學意義(P=0.993)。綜合分析結果提示，超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉均顯著降低AR大鼠因過敏導致的血清TGF-β1異常升高，其中超微粉效果最好，而普通粉與丙酸氟替卡松效果相當。

2.2 各組大鼠外周血清IL-17的表達

表2顯示，IL-17多重分析結果顯示， A組大鼠血清IL-17含量較正常對照組大幅升高，提示造模成功；D組大鼠血清IL-17含量較A組、B組及C組顯著下降(P<0.05)，與正常對照組比較差異無統計學意義(P=0.903)；B組大鼠血清IL-17含量較A組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠血清IL-17含量較A組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；B組大鼠血清IL-17含量較C組升高，差異有統計學意義(P=0.01)。綜合分析結果提示，超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉均降低了AR大鼠因過敏導致的血清IL-17異常升高，其中超微粉效果最好，普通粉次之，丙酸氟替卡松稍差。

表1 AR大鼠外周血各組TGF-β1的表達(±s)

表1 AR大鼠外周血各組TGF-β1的表達(±s)

組 別正常對照組空白模型組(A組)超微粉組(D組)普通粉組(C組)丙酸氟替卡松組(B組)FPTGF-β1(ng/ml)10.08±3.66#21.30±4.14*#△★13.53±4.36*17.75±3.77*★17.77±3.07*△12.875<0.001

注：正常對照組與A組比較：#P<0.01；B組與A組比較：△P<0.05；D組與A組、B組、C組比較：*P<0.05；C組與A組比較：★P<0.05；C組與B組比較：☆P<0.05

表2 各組大鼠外周血清IL-17的表達(±s)

表2 各組大鼠外周血清IL-17的表達(±s)

組 別正常對照組空白模型組(A組)超微粉組(D組)普通粉組(C組)丙酸氟替卡松組(B組)FPIL-17(ng/ml)577.20±43.28#753.42±66.66*#△★574.26±48.53*627.98±56.96*★☆692.30±50.23*△☆20.676<0.001

注：正常對照組與A組比較：#P<0.01；B組與A組比較：△P<0.05；D組與A、B、C組比較：*P<0.05；C組與A組比較：★P<0.05；C組與B組比較：☆P<0.05

3 討論

變應性鼻炎是常見的呼吸道變應性疾病，具有反復發作、遷延難愈的特點，全球平均發病率為10%～25%左右[8,9]。目前西醫治療以激素治療、免疫脫敏療法為主，但由于其實際療效不確切、副作用明顯等原因，僅有56%～58%的AR患者認為其治療有效[9]，因此較多患者選擇中醫藥療法進行治療。腧穴敷貼療法是臨床上廣泛應用的中醫藥療法之一，是集腧穴、藥物兩者作用于一體的獨特治療方法。臨床證實，腧穴敷貼療法對變應性疾病尤其是變應性鼻炎有獨特療效[10,11]。本實驗采用《張氏醫通》中記載的敷貼藥方，將其制成有效組分溶出率和生物利用率均更高的中藥超微粉，選取大椎、肺俞、腎俞進行腧穴敷貼治療。

AR的發生涉及一系列炎癥細胞(嗜酸粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞等)和眾多的細胞因子、趨化因子、轉錄調節因子以及炎癥遞質，此外還存在神經調節、遺傳學因素等作用[12]，機制尚未完全明確。雖然目前普遍認為變應性鼻炎與Th1和Th2失衡有關，但一些現象還不能完全用它來說明[13]。調節性T細胞(Treg)和Th17細胞的發現為解釋AR的發生以及炎癥程度起到了更好的補充。Treg細胞和Th17兩者在分化過程中具有相關性，正常情況下，TGF-β誘導初始CD4+T細胞分化為Treg；當伴有感染或炎癥時，IL-6和TGF-β共同啟動初始CD4+T細胞向Th17分化，從而誘導以Th17為主的炎癥應答[14]。雖然在分化上密切相關，但是在功能方面的研究表明，Thl7細胞的促炎癥反應機制對介導免疫耐受的Treg 細胞有明顯的拮抗作用[15,16]，當機體處于正常狀態下兩者保持平衡，但機體發生功能異常時常表現出Treg/Th17失衡，引起一系列炎癥反應損傷機體。在研究與AR有類似發病機制的疾病(如哮喘、自身免疫性疾病、鼻息肉)時發現，Th17/Treg細胞比率的失衡都在它們的發病機制中起重要作用[17,18]。因此也有研究推斷，Th17/Treg細胞的失衡與AR的發病機制密切相關[19]。

本實驗結果顯示，AR大鼠血清中TGF-β1和IL-17模型組較正常對照組均大幅升高，說明TGF-β1的表達增高促進了IL-17數量的增加，證實Veldhoen等[14]的實驗結果，TGF-β在誘導初始T細胞分化為Thl7細胞中起著重要作用。TGF-β1 3組藥物干預組與模型組比較差異有統計學意義，我們認為通過藥物治療使造模后升高的TGF-β1水平降低，這樣促使TGF-β1免疫抑制能力的恢復，從而抑制淋巴細胞的增殖以及Th17細胞的分化。伴隨著IL-17水平的降低，進一步控制AR的炎癥程度。IL-17 3組藥物干預組與模型組比較差異有統計學意義，以超微粉效果最好，說明3組藥物均能有效降低IL-17的水平，從而降低炎癥反應程度，進一步從動物實驗驗證臨床上變應性鼻炎的病情輕重與Th17細胞轉錄因子及IL-17水平的高低呈正相關。

通過綜合分析認為，本實驗中TGF-β1參與Th17細胞的分化，這與大多數研究結果一致。此外，目前普遍認為TGF-β與Th17細胞在功能上互相拮抗。本實驗中AR大鼠的TGF-β1與IL-17均升高，顯示TGF-β1對IL-17起正向調控的作用，同時IL-17又反作用于TGF-β1，在功能上起拮抗作用，與Annunziato F、Evans HG等結果一致[20，21]。但由于不同物種、不同疾病之間有不同的變化，因此TGF-β1也起到不同的調節作用。臨床及實驗研究證實了這一點。查閱有關AR患者及動物實驗的文獻發現，外周血TGF- β1的結果很不一致，分別有增高、降低和無變化的結果報道。但無法否認的是，TGF-β1確實參與了Th17細胞的分化，其含量的升高與IL-17的升高成正相關，說明TGF-β1與Th17促炎癥反應發生的程度有密切關系，兩者在維持AR免疫穩態的過程中發揮著重要的作用。

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