“綠葉中色素的提取”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

姚梁

筆者負(fù)責(zé)高中階段的生物實(shí)驗(yàn)工作，在長(zhǎng)期指導(dǎo)高中學(xué)生做“綠葉中色素的提取和分離”實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)即使是規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作后，仍有部分學(xué)生在最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中只能看到三條色素帶，另外一條很模糊甚至不能觀察到。刨去實(shí)驗(yàn)操作的誤差后，筆者苦思冥想，問題的癥結(jié)在哪里？筆者把目光放到色素的提取量上，是否是色素提取量不夠多？能否在高中提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)或者改造，提高色素的提取量，以便能更快速、高效地提取出色素？

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是提高色素的提取率，提取色素的原理是色素會(huì)溶于有機(jī)溶劑中，普通高中課程生物實(shí)驗(yàn)中提取色素所用的有機(jī)溶劑是100%乙醇10ML。那么其他常見有機(jī)溶劑的提取效果是否更好？光下操作和黑暗下操作結(jié)果是否一致？重新梳理了下實(shí)驗(yàn)思路之后，筆者閱讀和查看了大量的文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)提取色素常見的方法有：浸提法（soaking）和Arnon法。Arnon這個(gè)方法提出的時(shí)間較早，要點(diǎn)是將待測(cè)定的綠色材料用80%的丙酮溶液研磨并提取，經(jīng)過過濾或者是離心后，再用分光光度法測(cè)量綠色材料的光密度值，但是也有缺點(diǎn)：提取麻煩，操作復(fù)雜，研磨和去殘?jiān)芎臅r(shí)，這樣就不可避免會(huì)暴露在陽(yáng)光下，使得色素被分解，對(duì)操作的要求也比較高，造成誤差。浸提法是由Shoaf和Hiscox等人提出來(lái)的，是最早想到用化學(xué)物質(zhì)（二甲亞砜）浸提色素，這樣避免了Arnon需要過濾離心等復(fù)雜操作，使得提取更簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，但是由于提取時(shí)間長(zhǎng)，要看不同材料，以葉片變白為止，一般浸提時(shí)間至少需要0.5小時(shí)到2小時(shí)，有的甚至更長(zhǎng)。溫度還要維持在65°C，并且二甲亞砜有難聞的臭味且不好保存，成本高，所以該法經(jīng)過改進(jìn)，現(xiàn)在一般不用二甲亞砜，用其他的有機(jī)溶劑代替，比如陳福明、張憲政提出用混合液浸提法提取和測(cè)定色素的量，比如提取液?jiǎn)为?dú)用乙醇、丙酮、甲醇，后來(lái)還發(fā)展成有機(jī)溶劑進(jìn)行混合配比，比如丙酮：乙醇=1：1，丙酮：乙醇：水=5：5：1，丙酮：甲醇=1：1等不同比例的混合液，嘗試哪種混合比例為最佳。

我們都知道，光對(duì)色素來(lái)說具有破壞作用，高中實(shí)驗(yàn)課“綠葉中色素的提取”方法步驟中并沒有要求避光操作，那是否有無(wú)光照是個(gè)無(wú)關(guān)變量，有沒有影響色素的提取量？帶著這些問題，筆者綜合考慮上述因素，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，試著在高中實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，通過設(shè)置分組對(duì)照，對(duì)比不同有機(jī)溶劑及其混合液（由于實(shí)驗(yàn)室條件限制，選取丙酮：乙醇=1：1）和光照對(duì)色素提取的影響，用分光光度法定量測(cè)葉綠素含量，間接反映色素的量的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑

新鮮菠菜葉，研缽，SP2000型可見分光光度計(jì)，SiO2，CaCO3，按體積比配制不同的提取液（乙醇10ML，丙酮10ml，甲醇10ML，均為分析純）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）將試管均分成8組，每組分組編號(hào)，4組處于自然光下實(shí)驗(yàn)A1，A2，A3，A4，另4組處于昏暗處實(shí)驗(yàn)B1，B2，B3，B4。

（2）將菠菜葉洗凈擦干，用剪刀在菠菜相同葉片位置取材（避開葉片莖稈），剪碎混勻，每組5g，放在各個(gè)研缽中。

（3）向8個(gè)研缽中放入少許等量SiO2，CaCO3，再分別加入提取液如下表：

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（4）等速研磨3分鐘。

（5）將每組研磨液迅速進(jìn)行過濾，將濾液收集到試管中，塞緊試管口。

（6）用SP2000型分光光度計(jì)測(cè)葉綠素的含量，試測(cè)3次后，等待光吸收值穩(wěn)定下來(lái)，再測(cè)量并計(jì)算葉綠素的含量，重復(fù)3次，求平均值，并在340～710光波段掃描吸收光譜并制圖。葉綠素含量用Arnon法的公式：

葉綠素a=（12.7A664-2.69A646）×■

葉綠素b=（12.7A646-2.69A664）×■

葉綠素總量=（20.0A646+8.02A664）×■

或葉綠素總量=■×■

其中A664，A646，A651分別為對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光密度值，V為綠葉材料提取液的體積，W為綠葉的鮮重。

3.結(jié)果分析

（1）葉綠素的吸收光譜比較

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圖1 8組不同葉綠素提取液吸收光譜圖

（A1，A2，A3，A4畫實(shí)線；B1，B2，B3，B4畫虛線）

圖1表明，8組實(shí)驗(yàn)吸收光譜曲線總體相似，波峰集中在430nm～445nm和660nm～670nm之間，波谷集中在554nm和606nm左右，說明不同提取液對(duì)菠菜吸收光譜的影響微弱。同時(shí)，不管是在光照下，還是在昏暗條件測(cè)量，8種葉綠素提取液的吸收光譜曲線也大體相似，說明是否有光對(duì)葉綠素吸收光譜的影響不大。

（2）不同提取液提取葉綠素的含量比較

表1 不同條件，不同提取液提取葉綠素的動(dòng)態(tài)變化

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分析表1結(jié)果，從數(shù)據(jù)的量來(lái)看，菠菜提取量的區(qū)分度差別不大，但是還是可以看到一些細(xì)微的區(qū)別和規(guī)律，具體體現(xiàn)在兩點(diǎn)上：

一是總體觀察表1，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)規(guī)律，不管是葉綠素a、葉綠素b，還是總?cè)~綠素的量，An大于Bn，昏暗下提取的葉綠素的量比光下提取的量要更多些，這也就是說明：光對(duì)葉綠素的提取有破壞作用，在無(wú)光條件下提取量更多，所以，有條件的話最好在昏暗或者黑暗環(huán)境下進(jìn)行操作，這樣提取的色素量更多。

二是通過數(shù)據(jù)分析，對(duì)比不同提取液的提取效率，可以看出，乙醇：丙酮=1：1的提取液提取出來(lái)葉綠素量最多，效果最佳，課本中的例子乙醇提取效果次之，然后是丙酮，最后是甲醇。這說明：課本中的實(shí)驗(yàn)有改進(jìn)的可能，有機(jī)溶劑乙醇不一定提取效率最高。當(dāng)然，對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)來(lái)講，由于條件的限制，對(duì)于混合液的種類和比例，筆者的選擇標(biāo)準(zhǔn)是高中階段常見的3種有機(jī)溶劑及其比例，在這個(gè)效果下選出最佳。實(shí)際中，可能還有其他更優(yōu)的配比還沒找到，筆者試著給生物實(shí)驗(yàn)工作提供一個(gè)思路，希望能提高提取效率。

當(dāng)然，通過對(duì)表格提取量的定量分析，對(duì)高中生物實(shí)驗(yàn)而言，這些提取量數(shù)據(jù)區(qū)分度也不算特別明顯。我們?cè)谧錾飳?shí)驗(yàn)的時(shí)候，除了要考慮提取量之外，還要考慮到操作的簡(jiǎn)易程度和各個(gè)學(xué)校的實(shí)際情況，盡量做到操作和效果上的平衡。

參考文獻(xiàn)：

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[3]蘇正淑，張憲政.幾種測(cè)定植物葉綠素含量的方法比較[J].植物生理學(xué)通訊，1989（5）：77-78.