橡膠草種植前后土壤微生物細菌多樣性研究（Ⅰ）

梁素鈺　李琳　杜倩等

摘要[目的]對開墾荒地種植橡膠草前后的土壤微生物細菌多樣性進行454測序技術并對基礎數據進行分析，探求利用邊際土地進行戰略能源作物種植的可行性。[方法]通過蛇形取樣法對土壤樣品采集、用試劑盒提取土壤微生物總DNA、選擇細菌16SrDNA V3～V1區，進行引物設計與PCR預擴增，采用454測序技術獲得數據序列并優化，用R軟件進行指數多樣性等基礎分析。[結果]樣品總DNA無蛋白質和RNA污染，PCR預擴增出500 bp左右的細菌16S rDNA。454測序序列優化序列占有效序列的90%以上，在97%相似性水平下的指數多樣性顯示橡膠草種植后土壤細菌OTU數目較多；ShannonWiener曲線和稀釋性曲線顯示，當測序序列細菌超過15 000時曲線趨向平坦。[結論]試驗測序數據可以反應樣品中絕大多數微生物信息，此次取樣的數量比較合理，細菌豐富度高。

關鍵詞橡膠草（Taraxacum koksaghyz Rodin）；454測序；細菌；多樣性；土壤微生物

中圖分類號S576文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02563-02

基金項目國家林業局948，編號201304SC2，2011451；黑龍江省財政，編號201102；黑龍江省森工總局，編號sgzjY2012010；黑龍江省博士后，編號LBHQ10010）。

作者簡介梁素鈺（1970- ），女，黑龍江哈爾濱人，副研究員，博士，從事生物能源與技術研究。

橡膠草（Taraxacum koksaghyz Rodin）是菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum）多年生宿根草本產膠植物，首先于20世紀30年代在前蘇聯被發現，并對橡膠草體內橡膠的形成[1-2]及品質變化[3-4]、體內碳水化合物[5-6]、果聚糖[7]、多酚氧化酶及化合物[8-9]和脫氫酶[10]等進行了研究。中國在20世紀50年代初，為解決國內天然橡膠供應不足問題，中央輕工業部曾組織調查團前往新疆對發現的大面積野生橡膠草進行全面考查[11-12]。

近年來，隨著橡膠草作為替代巴西橡膠的可用資源之一[13-17]，人們對橡膠草的研究維度更加多樣化，從田間種植[18]，組織培養[19-22]、到分子水平的蛋白質[23-24]、轉基因[25-27]、遺傳圖譜多樣性[28]和基因克隆[29-30]等進行了一系列的研究。筆者主要是利用454技術[31-32]研究北方田間種植橡膠草前后的土壤微生物細菌的多樣性，并對所測序列進行基礎數據分析，以期為橡膠草的進一步開發利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料于種植1年橡膠草的土地和未種植地，以5 m×5 m為試驗單元，盡量靠近橡膠草根蛇形取土樣5個，每個樣品50.0 g，混合，過40目土壤篩。樣品用錫紙包裹，置于液氮中帶回實驗室。試驗中用KOK表示橡膠草種植后的樣本，用CK表示橡膠草種植前的樣本。

1.2方法

1.2.1土壤總基因組的提取與純化。利用土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）進行微生物基因組DNA的提取和純化，土樣取0.25 g，提取完成后，取1 μg DNA上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2454測序進行PCR擴增時引物選擇。檢測細菌選擇16SrDNA V3～V1區，進行引物設計與PCR擴增。擴增引物為 27F：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3；533R：5TTACCGC GGCTGCTGGCAC3（測序端）。

1.2.3有效序列數據及優化序列數據。對2個樣品混合測序后，去除測序接頭、barcode和前引物（forward primer）序列，并對處理后的有效序列和優化序列數據進行分布統計。

1.2.4OTU聚類分析。對所測細菌序列進行歸類操作，按照彼此的相似性歸為許多小組，1個小組就是1個OTU（Operational Taxonomic Units，可操作的分類單元），來自1個菌。試驗基于97%的相似度，對所有細菌序列進行OTU聚類并進行生物信息統計分析。

1.2.5多樣性分析。試驗使用R軟件，應用菌群豐度指數Chao、Ace，菌群多樣性指數Simpson、Shannon和測序深度指數Coverage和ShannonWiener曲線反應樣品的微生物多樣性指數，用稀釋性曲線比較測序數量不同的樣本物種的豐富度和樣本的取樣大小。

2結果與分析

2.1DNA的提取與PCR擴增圖1表明，2個樣品均獲得質量良好的總DNA，無蛋白質和RNA污染，可進行PCR擴增。細菌PCR均預擴增出500 bp左右的條帶，無拖尾現象。

注：M為DL2000；90為KOK；100為CK；（a）為樣品總DNA；（b）為細菌16srDNA PCR。

2.2樣品序列數據的分析由表1可知，優化后的序列長度占有效序列的90%以上，滿足試驗分析要求。

2.3橡膠草土壤細菌多樣性分析

2.3.2ShannonWiener曲線分析。圖2表明，這2個樣本的曲線離得比較近，當細菌測序序列超過15 000時，曲線趨向平坦，說明試驗選取細菌測15 000條序列時能反應樣品中絕大多數微生物信息，所測序的數據具有高的可信度，可真實地反應試驗結果。

2.3.3稀釋性曲線（rarefaction curve）分析。該分析是在97%相似性水平下劃分OTU并制作樣品的稀疏曲線，當細菌達到15 000，曲線有趨向平坦趨勢，說明此次取樣的數量比較合理（圖3）。注：90為KOK；100為CK。

3結論與討論

試驗主要針對土壤樣品的采集、DNA的提取、PCR預處理以及獲得樣品的測序數據進行的基礎分析。用454技術研究土壤微生物，在土壤樣品的準備上，為了盡可能接近土壤內真實微生物的組成，在取樣時第一時間將樣品原地處理后，存于液氮中保存。但在試驗過程中，DNA的提取、純化以及PCR引物的設計和擴增，都會對所測序列產生影響。該試驗中的PCR是預試驗，主要目的是為了檢測基因組DNA是否可以進行后續的454測序。

序列優化是為了去除測序過程中出現的冗余數據，其中不含所設計序列的數據不可用于后續分析。試驗數據分析是在0.03水平上，即97%相似性，選取數據并進行分析。在分析過程中，也可以根據需要選取0.1或者0.01等不同程度的相似性水平所獲得的數據，那就要看實際優化的序列是否可以滿足試驗分析要求。