1株能夠分解木質素的泛菌的分離與鑒定

蔡紅丹　張衡　劉權

摘要木質素緊密結合在纖維素外層，由于其結構的復雜性和穩定性，是纖維素資源利用中的一大障礙。目前微生物降解木質素的研究主要集中在以白腐菌為代表的真菌上，細菌在木質素降解中的作用有待研究。試驗從洋蔥腐爛莖稈中取土樣，經過堿木質素為唯一碳源的限制性篩選和繼代培養，并以愈創木酚為唯一碳源的培養基進行顯色反應，最終得到了一株具有木質素分解能力的細菌。通過16S rDNA和gyrB基因測序對該菌株進行鑒定，發現該細菌屬于泛菌屬。與泛菌屬的植物病原菌不同，該細菌不具備致病性，可用于進一步的木質素的細菌分解以及纖維素的綜合利用研究。

關鍵詞木質素；分解；泛菌

中圖分類號S182文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02559-02

基金項目黑龍江八一農墾大學校級大學生創新創業訓練計劃項目。

作者簡介蔡紅丹（1991- ），女，黑龍江大慶人，本科，專業：生物技術。*通訊作者，副教授，從事微生物資源利用研究。

木質素是由苯丙烷結構單元通過醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維網狀高分子芳香族化合物，在自然界中分布非常廣泛，主要存在于木本和草本植物的莖稈中。木質素緊密包圍在纖維素的纖維外層，由于其結構復雜，分子量大，很難被微生物吸收利用，因此成為了纖維素資源利用中的一個障礙。

在自然界中，木質素的微生物分解是由真菌、細菌等各種微生物群落共同作用的結果[1]。目前，木質素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌為代表的真菌上。白腐真菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質素，包括木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、錳過氧化物酶（Manganesedependent peroxidase，MnP）和漆酶 （Laccase），因此被認為是最主要的木質素降解微生物[2-3]。雖然此類真菌具有較好的分解效果，但若要將其應用到去除纖維素外層的木質素的生產應用中，存在2個嚴重問題：一是白腐真菌的生長緩慢，產酶量低，難以放大到工業化生產應用；二是白腐真菌在分解木質素的同時必須以纖維素為碳源維持自身生長，會導致降解木質素的同時也降解纖維素，達不到纖維素資源有效利用的目的。因此，有必要尋找其他途徑來實現木質素的快速分解和纖維素的有效利用。

細菌降解木質素的能力較真菌差，但是由于細菌的生長周期短，易于培養，適合大規模生產應用。此外，在木質素的降解過程中，細菌發揮了一些關鍵性作用，如支鏈的改性、環開裂和解聚等。因此，細菌在木質素分解中的作用也不容忽視[4-5]。在細菌分解木質素的研究中，發現了一部分對木質素有降解效果的細菌，主要包括鏈霉菌（Streptomyces）、節桿菌（Arthrobacter）、小單孢菌（Micromonospora）等放線菌，還有假單胞菌（Pseudomonas）、黃桿菌（Flavobacterium）等非絲狀細菌[6-8]。這些細菌能夠分解不同聚合形態的木質素，在木質素降解的不同階段發揮作用。此外，有一些研究報道了這些菌株能夠分泌一些過氧化物酶類，可以對木質素的一種人工聚合形式——硫酸鹽木質素進行降解[9]。這說明細菌在降解木質素的過程中發揮著不可或缺的作用，針對細菌對木質素降解的研究值得進一步開展。筆者針對以上問題，開展了能夠分解木質素的細菌的篩選工作，并通過16S rDNA和gyrB基因測序對該菌株進行鑒定，以期為分解木質素的細菌的進一步研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料從洋蔥腐爛莖稈中取樣，經過堿木質素為唯一碳源的限制性篩選和繼代培養，并經過愈創木酚為唯一碳源的顯色反應，最終得到一株具有木質素分解能力的細菌，

1.2方法

1.2.1微量元素混合液。FeCl3·6H2O 0.16 g，ZnSO4·7H2O 1.5 g，CoCl2·6H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.15 g，MnSO4·H2O 1.5 g，H3BO3 0.3 g，Na2MoO4·2H2O 0.1 g，蒸餾水定容至1 L，使用前使用0.22 μm濾器過濾除菌。

1.2.2初次選擇培養基。堿木質素 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸餾水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min。

1.2.3 2次選擇培養基。愈創木酚 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸餾水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min。

1.2.4LB固體平板。蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min，冷卻后倒入培養皿。

1.2.5目的菌株的篩選。從洋蔥腐爛莖稈中取土樣1.00 g，加入含有玻璃珠的200 ml三角瓶中，加蒸餾水50 ml，于150 r/min振蕩1 h，靜置5 min，取懸浮液以10%的接種量加入到100 ml初次選擇培養基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養5 d。將培養液以10%的接種量加入到100 ml初次選擇培養基中，循環培養5次。

取懸浮培養液涂布到LB固體平板上，37 ℃倒置靜止培養24 h，得到布滿單克隆的平板。挑取不同外觀的克隆接種到5 ml的2次選擇培養基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養5 d，觀察顏色反應，培養液顏色變為紫紅色的即為目的菌株。取目的菌株的懸浮培養液涂布到LB固體平板上，37 ℃倒置靜止培養24 h，單克隆的目的菌株。

1.2.6目的菌株的鑒定。為了對該菌株進行分子鑒定，使用細菌16S rDNA 引物對該菌株進行PCR擴增，引物為：784F（AGGATTAGATACCCTGGTA） 和1061R （CGACACGAGCTGA- CGAC）。PCR擴增條件為：95 ℃預變性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，其余PCR產物通過PCR產物純化試劑盒進行純化，連同引物送交華大基因測序。

為了進一步鑒定該菌株，針對Pantoea ananatis的gyrB基因的保守區進行引物設計。上游引物為GGTGGTATCCGTACAAGTA，下游引物為GAAACGCCTCGTTCTTGC。PCR擴增條件為：95 ℃預變性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，其余PCR產物通過PCR產物純化試劑盒進行純化，連同引物送交華大基因測序。將該菌株的16S rDNA和GyrB基因序列利用NCBI Blast數據庫進行同源性分析，使用MEGA軟件構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1目的菌株的獲得試驗從洋蔥腐爛莖稈中取樣，經過堿木質素為唯一碳源的選擇性培養后，得到4種不同外觀的克??；將這4種克隆分別加入愈創木酚為唯一碳源的2次選擇培養基后，僅有1種克隆發生了顏色反應，使培養液顏色變為紫紅色。經過初步的生理鑒定，該菌株為革蘭氏陰性菌，菌落外觀形態為圓形，顏色為不透明乳白色，長時間培養后會呈現黃色（圖1）。

3結論與討論