不同血清濃度對金華豬耳緣組織成纖維細胞體外生長的影響研究

屠平光，項 云，章嘯君，樓芳芳

(金華市農業科學研究院，浙江金華321000)

成纖維細胞是結締組織中最常見的細胞，特征為生長較快、細胞和細胞核較大，顯微鏡下可觀察到清晰輪廓，呈典型梭形、星形或多邊形，細胞核為卵圓形［1］。目前，成纖維細胞被廣泛用于生產體細胞克隆豬［2－3］、轉基因豬及制作豬誘導多功能性干細胞［4－5］。

金華豬是我國優良地方豬種，體型中等偏小，具有基因較純、遺傳性穩定、表型均一和遺傳背景清楚等優點，是目前生物醫學、異種器官移植、人類疾病模型建立等領域研究的理想材料。由于動物遺傳資源能夠以細胞系的方式保存［5］，因此優化培養體系，建立穩定的金華豬耳緣組織成纖維細胞系，可以使金華豬這一寶貴的遺傳資源在細胞學水平上得到長期保存，為體細胞核移植、轉基因和異種器官移植等相關研究提供技術基礎。

本試驗采用組織塊貼壁法培養金華豬耳緣組織成纖維細胞，并在不同血清濃度下，觀察其對金華豬耳緣組織成纖維細胞體外生長的影響，為進一步改進其培養技術、篩選更好的細胞培養體系提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 培養基(DMEM)，胎牛血清(FBS)，青霉素、鏈霉素混合液(含青霉素10000 u/mL、鏈霉素10 μg/mL);0.25%胰蛋白酶溶液，PBS液均為Hyclone 公司產品。

倒置顯微鏡OLYMPASCKX41;二氧化碳培箱Thermo311 型;酶標儀伯樂680 型。

1.2 培養方法

1.2.1 取材 采集金華豬耳緣組織浸入PBS 液中，置實驗室無菌操作臺，用75%酒精浸泡45 s 后，放入含雙抗的PBS 液中漂洗數次，以確保組織無菌。

1.2.2 組織塊貼壁培養法 將組織塊置于培養皿中，加入完全培養液，用眼科剪刀反復剪切組織塊，剪成1 mm3大小的小塊。用眼科鑷子將組織小塊在無菌60 mm 培養皿中均勻擺放，間距約0.3 cm。放置后，輕輕翻轉培養皿，倒置放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。4 h 后，待培養皿中組織半干貼附后，慢慢翻轉平放培養皿，輕輕加入含5%、10%、15%血清的培養基中，注意防止組織塊漂浮，標記后放入CO2培養箱中繼續培養。2 d 后取出，置于倒置顯微鏡下觀察組織塊遷移率，同時進行換液［6］。

1.2.3 傳代培養 待原代細胞匯合成片，約占培養皿底面積80%～90%時，進行傳代培養。傳代前24 h 內更換新鮮培養液。取出培養皿后，置于無菌操作臺內，倒棄原培養液，加入2 mL PBS 液清洗細胞2 次后，在培養皿中加入消化液0.5 mL，輕輕振蕩，倒置顯微鏡下觀察，待大部分細胞變圓、漂浮后，在培養皿中加入4 mL 培養液終止消化，輕輕吹打，使細胞分散。以1000 r/min、離心5 min，棄上清液，再加入2 mL 培養液吹打重懸浮細胞，再次以1000 r/min 、離心5 min，棄上清液，以2 mL 培養液吹打重懸浮細胞，使用血球計數板和0.4%臺盼藍染液進行活細胞計數，使細胞密度為2 ×105個/mL。隨后，接入新培養皿中，置37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中繼續培養。

1.3 耳緣成纖維細胞純化 成纖維細胞與上皮細胞對胰蛋白酶的敏感度不同，成纖維細胞對消化液較上皮細胞敏感，合適時間可以使成纖維細胞脫壁，而上皮細胞則仍然貼在瓶壁上。

經過2～3 次消化傳代后即可得到純化的成纖維細胞。

1.4 MTT 法檢測血清濃度對細胞數量的影響 用傳代培養的第3 代細胞胰酶消化，分別用含不同濃度的血清配成單個細胞懸液，以每孔1 ×104個/mL細胞接種于96 孔培養板中，每組10 孔，培養2 d后，取出培養板進行檢測。

每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20 μL，繼續培養4 h 后終止培養，輕輕吸棄孔內培養上清液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇波長490 nm，用酶標儀測定各孔光吸收值(A 值)。

1.5 數據處理 對不同濃度血清培養的金華豬耳緣組織成纖維細胞的MTT 結果，采用方差分析。

不同組別數據間比較采用t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 倒置顯微鏡觀察結果 采用組織塊貼壁培養法血清濃度為10%與15%時，培養4 d 后即有細胞沿組織塊周圍生長出現(圖1－1)，培養8 d 后成纖維細胞呈優勢生長狀態(圖1－2)，培養13 d 左右即可長滿培養瓶底(圖1－3)。血清濃度為5%時，4 d 后未見細胞沿組織塊周圍出現，10 d 后才見少量細胞沿組織塊周圍出現，21 d 左右才鋪滿培養瓶底。

細胞經2～3 次消化傳代后即可得到純化的成纖維細胞，細胞呈梭形、三角形，為典型的成纖維形態，胞質近中央處有橢圓形胞核。成群細胞呈束狀、漩渦狀(圖1－4)。

圖1 組織塊貼壁培養法成纖維細胞生長態勢

2.2 MTT 檢測結果 金華豬耳緣組織成纖維細胞在10%、15%血清培養基中，細胞生長旺盛，活力較強，差異不顯著(P ＞0.05);在5%血清培養基中，細胞生長緩慢，細胞活力明顯低于10%與15%血清培養基中的細胞，差異顯著(P ＜0.05)。詳見表1。

表1 3 種濃度血清培養的細胞光密度值

3 小結與討論

本次試驗，采用組織塊貼壁方法培養的成纖維細胞形態良好，且在細胞傳代后極少出現無法貼壁的死細胞，穩定傳代10 次后，細胞形態未出現衰老等變化，長滿90%左右時，成群細胞呈束狀或漩渦狀生長。

據本次試驗，10%～15%胎牛血清濃度即可滿足金華豬耳緣組織成纖維細胞的生長需求，且10%、15%血清濃度對細胞生長影響的差異不顯著。所以采用10%血清濃度培養金華豬耳緣組織成纖維細胞可以完全滿足實驗需要。血清濃度為5%時，則不能滿足細胞生長需要，雖細胞仍在生長，但速度較慢，培養器皿底部尚未鋪滿，細胞一直處于增殖狀態，但未出現平臺期。

綜上所述，血清濃度對金華豬耳緣組織成纖維細胞生長影響比較明顯，血清濃度為10%、15%時，二者對細胞生長狀況的影響差異不顯著(P ＞0.05)，二者與血清濃度為5%時對生長狀況的影響，則差異顯著(P ＜0.05)，表明不同血清濃度的培養體系在對體外培養金華豬耳緣組織成纖維細胞有著明顯影響。

血清是一種很復雜的混合物，含有豐富的細胞生長必須的營養成分，能維持細胞成活，促進細胞增殖。可能與血清中所含VEGF、EGF、bFGF 等多種細胞生長因子有關，細胞生長因子對細胞增殖影響均存在一定的量效關系［7］。因此，筆者認為在血清濃度為10%條件下采用組織塊貼壁培養法獲取的原代金華豬耳緣組織成纖維細胞形態良好、增殖能力較強，群體倍增時間較短。

［1］程旭梅，倪黎綱，吳曉偉，等.豬皮膚組織塊冷凍保存方法的研究［J］.揚州大學學報:農業與生命科學版，2008，29(3):67－71.

［2］Betthauser J， Forsberg E， Augenstein M， et al.Production of cloned pigs from in vitro systems［J］.Nat Biotechnol，2000，18(10):1055－1059.

［3］Polejaeva I，Chen S，Vaught T，et al.Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells［J］.Nature，2000，407(6800):86－90.

［4］Lai L，Kolber-Simonds D，Park K，et al。Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning ［J］.Science，2002，295(5557):1089－1092.

［5］吳常信.動物遺傳資源保存的理論與技術——21 世紀動物農業持續發展的種質基礎［J］.云南大學學報，1999，21(1):7－10.

［6］周福臨，張嬌，等.不同濃度血清對人成纖維細胞生長的比較研究［J］.中國美容整形外科雜志，2007，18(4):308－311.

［7］李云劍，林樾，燕辛，等.培養基血清濃度對人表皮干細胞增殖分化的影響［J］.現代生物醫學進展，2010，20(3):3831－3833.