基于ISSR分子標記技術的山核桃幼胚DNA甲基化初步研究

李順福，胡恒康，張秋露，徐艷玲，張啟香

（1.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

山核桃Carya cathayensis是果木兼用的優良經濟樹種，主要分布在浙皖交界的天目山區[1]。目前，山核桃主要采用實生苗繁殖與嫁接繁殖。實生苗繁殖難以保持品種的優良特性[2]。山核桃體細胞胚具有完整的兩極結構，能一次再生形成完整植株[3]。因為生產對良種苗木的需要，山核桃的離體繁殖技術已得到了較深入的研究[4]。表觀遺傳是指在DNA序列不改變的情況下發生的可遺傳的基因表達改變，DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種方式[5]，是指在DNA甲基轉移酶催化下以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶，不改變DNA一級結構對基因序列進行修飾而影響基因的表達，影響其功能，這種甲基修飾主要發生在CpG雙核甘酸序列的胞嘧啶上[6]。已有眾多證據表明：DNA甲基化參與了植物不同發育階段的生長調控[7]。研究發現，以山核桃幼胚為外植體進行體胚誘導，不同發育時期幼胚胚性感受態差異較大，其中自然授粉后8～10周可誘導產生愈合組織，11～12周可從幼胚子葉表面直接誘導產生體細胞胚[8]。山核桃不同程度胚性感受態是否由于不同發育時期幼胚基因組表觀遺傳的變化引起，尚未見相關研究報道。本研究應用簡單序列重復區間擴增（inter-simple sequence repeat，ISSR）DNA分子標記技術對山核桃幼胚生長過程中DNA甲基化變化動態進行研究，揭示山核桃幼胚發育過程中甲基化變化規律，以期對建立高效的山核桃體細胞胚發生體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

7月上旬于浙江省臨安市板橋鄉羅塘村采集自然授粉后9，10，11，12，13周的山核桃幼果（分別以樣本第9周，第10周，第11周，第12周，第13周代替）。將幼果帶回實驗室中剪去花柱及柱頭，洗滌劑洗凈表面后，用體積分數為75%乙醇涮洗30 s，自來水沖洗干凈，于超凈工作臺上去除果皮和種皮后取出完整的幼胚，提取基因組DNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 山核桃幼胚DNA的提取 用改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取實驗材料的基因組 DNA[9]。

1.2.2 哥倫比亞大學（UBC）公布的引物的篩選 用提取的不同時期培養的山核桃幼胚的一組DNA為模版，所用引物參照加拿大哥倫比亞大學網站公布的第9套ISSR引物序列，對100個引物進行篩選，選取擴增條帶多而清晰、分離度高的引物。本實驗共篩選出共17個引物，分別是：UBC808， 809， 815， 816， 817， 822，825， 827， 830， 834， 840， 855， 858，862，867，888，889。17個引物序列如表1。

1.2.3 DNA酶切 取5個不同時期培養得幼胚DNA樣品，分別用HapⅡ和MSPⅠ等2種酶切，反應體系為30 μL，所用DNA質量濃度為50 mg·L-1，為了使酶切完全，加入3倍完全酶切的用量，酶切過夜后在65℃水浴鍋10 min使酶失活。

1.2.4 ISSR-PCR建立 分別以各個材料未酶切，HapⅡ和MSPⅠ等2種酶切的基因組DNA為模版，以篩選的17個UBC引物進行聚合酶鏈式反應（PCR）。PCR反應條件：94℃ 預變性5 min，94℃變性30 s，適溫退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環后72℃延伸10 min。擴增產物用質量分數為20.0 g·kg-1瓊脂糖凝膠電泳檢測[10]。

1.2.5 山核桃幼胚基因組DNA甲基化水平分析 MspⅠ和HapⅡ對相同酶切位點甲基化的敏感程度不同以及ISSR是顯性標記是分析甲基化變異的理論基礎[11]。同裂酶MspⅠ和HpaⅡ的酶切位點均為“CCGG/GGCC”，由于兩者對該位點胞嘧啶甲基化的敏感程度不同，經PCR反應擴增多態性片段就反映出該位點的甲基化狀態及程度。MspⅠ能切割無甲基化和內甲基化位點而不能切割外甲基化位點，HpaⅡ能切割無甲基化和單鏈甲基化（雙鏈中只有鏈甲基化）而不能切割雙鏈甲基化[12]。因而DNA分別用MspⅠ和HpaⅡ酶切后選擴，根據帶型的有無可能出現4種甲基化類型，Ⅰ型：都有帶，代表該位點存在外側胞嘧啶全（雙鏈）甲基化或無CCGG位點；Ⅱ型：都無帶，代表該CCGG位點無甲基化或為內側胞嘧啶半（單鏈）甲基化；Ⅲ型：HpaⅡ有帶而MspⅠ無帶，代表該位點為內側胞嘧啶半（雙鏈）甲基化；Ⅳ型：HpaⅡ無帶而MspⅠ有帶，代表該位點為外側胞嘧啶半（單鏈）甲基化。由表2可知：Ⅲ型為全甲基化，Ⅳ型為半甲基化，但Ⅰ型和Ⅱ型的全/半甲基化狀態僅根據條帶位點還不確定，需進一步根據不同時期同一引物的同一位點條帶差異來判斷胞嘧啶全/半甲基化變異（表3）。

表1 篩選的引物序列Table1 Primers for ISSR

表2 ISSR未酶切和甲基化敏感酶HpaⅡ和Msp I酶切產生的條帶類型Table2 DNA methylation band types of uncut,HpaⅡand Msp I of ISSR

2 結果與分析

2.1 山核桃幼胚不同發育時期對DNA甲基化類型的影響

17個引物在各個發育時期山核桃幼胚樣品中共擴增檢測到的128個甲基化位點。5個時期幼胚甲基化比例依次為23.44%，25.78%，28.90%，40.62%和42.19%。甲基化比例隨著胚的發育逐漸升高。研究結果同時表明，5個時期幼胚甲基化類型較豐富，4種甲基化類型均存在（圖1-1～4）。由表4可知：在17個引物中，引物809擴增位點數最多，為11個，其中，第9周的Ⅰ～Ⅳ類型的擴增位點數分別為7，4，0，0；第10周的Ⅰ～Ⅳ類型的位點數分別為7，4，0，0；第11周的Ⅰ～Ⅳ型的位點數分別為7，4，0，0；第12周的Ⅰ～Ⅳ型的位點數分別為6，4，1，0；第13周的Ⅰ～Ⅳ型的位點數分別為6，4，1，0。圖2表明：隨著幼胚的發育，4種DNA甲基化類型呈現規律性變化。第1種類型位點數最多，從第9周至13周DNA甲基化類型Ⅰ呈逐漸上升趨勢，而Ⅳ型呈逐漸下降趨勢；但在Ⅱ型、Ⅲ型中，各發育階段變化相對平穩（圖2）。

表3 Ⅰ型和Ⅱ型甲基化狀態判斷標準Table3 DNA methylation of typeⅠand typeⅡ

2.2 山核桃幼胚不同發育時期對胞嘧啶全/半甲基化變異的影響

進一步分析表明：5個時期均存在全甲基化位點和半甲基化位點。5個時期全甲基化位點數分別為10，11，21，31，32，所占比例分別為7.81%，8.59%，16.40%，24.22%和25.00%；5個時期半甲基化位點數分別為 20，22，16，21，22，所占比例分別為 15.62%，17.19%，12.50%，16.41%，17.19%。由此可知：山核桃幼胚5個發育時期在基因組DNA甲基化水平上存在著較大差異，不同時期幼胚之間基因組DNA全/半甲基化位點的絕對數量和相對數量都有不同程度的改變。盡管總甲基化比例及全甲基化位點比例隨著胚齡的增加而逐漸升高；半甲基化位點所占比例呈小幅波動并基本持平狀態（表 5）。

圖1 山核桃幼胚不同發育時期的DNA甲基化類型Figure1 DNA methylation band types of different development stages of immature embryos of Carya cathayensis

3 討論

DNA甲基化是植物正常生長發育所必需的，但是甲基化水平不足，也會導致不正常生長[13]。在高等植物基因組中，DNA甲基化在發育過程中處于一個動態的變化之中，同一物種在不同的發育時期，甲基化水平會發生變化，而且不同植物的變化趨勢是不一樣的[14]。越來越多的試驗結果表明，DNA甲基化對植物正常發育起重要作用。對某些植物的研究發現：如果在基因組的重要位點上誘導產生或自然發生DNA甲基化的變異，就會引起廣泛的發育異常現象[15]。油菜Brassica campestris種子在萌發時伴隨著大量的去甲基化事件，導致甲基化水平的降低[16]。在同一植株的同一發育時期在不同組織中，DNA甲基化也有所差異，研究發現水稻Oryza sativa在幼苗時期的甲基化水平高于旗葉[17]。在不同的植物之間，同源的 DNA序列的甲基化水平差異也非常明顯，對11個不同被子植物的 25S rDNA的甲基化研究發現，這些物種的甲基化水平差異較大，其中擬南芥Arabidopsis thaliana低至4%，而豌豆Pisum sativum和洋蔥Allium cepa高達80%和90%[18]。前人的研究資料表明[19]，植物在發育過程中，胞嘧啶的甲基化對基因具有重要的表達調控作用，在基因的內部或鄰近區域發生甲基化可以抑制這些基因的表達，而去甲基化后又可以激活基因的表達。

本研究用適當的PCR擴增反應從100個ISSR引物中篩選了17個引物，選擇引物的標準是它們能產生和再次產生清晰的、多態性豐富的擴增產物（圖3）。在5個時期山核桃幼胚中，17條ISSR標記共產生了128個擴增條帶。研究結果表明：5個發育時期山核桃發生了不同程度的甲基化模式和水平的變化，如DNA甲基化比例隨著幼胚的發育逐漸升高，暗示部分基因正在關閉。同時，對于這些基因而言，去甲基化可能是基因進一步表達的必須步驟。這似乎表明：植物通過DNA甲基化和去甲基化的方式實現基因的有序表達[20]。根據全/半胞嘧啶甲基化均被觀察到的結果，我們推測甲基化變異可能與幼胚成熟的一些重要屬性有關。本研究在用 MspⅠ和 HapⅡ酶切 ISSR圖譜和未酶切圖譜比較時，還觀察到了一種特殊的現象，即酶切后出現了未酶切沒有的新條帶（圖3，箭頭所示）。理論上酶切ISSR圖譜的出現的條帶必然在未酶切ISSR圖譜中出現，這種情況可能由于未酶切基因組存在一定的構象造成PCR引物結合困難，酶切后引物可以結合上去[21]。因此，盡管本研究已獲得山核桃幼胚發育DNA甲基化狀態的初步結果，但由于本研究尚未應用特異條帶回收并雜交驗證，關于山核桃幼胚不同發育階段基因表達與基因組DNA甲基化以及胚性感受態之間關系還需要進一步探索。

圖2 發育時期對山核桃幼胚甲基化類型的影響Figure2 Effect of development stage on DNA methylation types of immature embryos of Carya cathayensis

表4 ISSR在不同發育階段幼胚的DNA甲基化類型統計Table4 DNA methylation types on different development stages of immature embryos of ISSR

表5 ISSR在不同發育階段幼胚的胞嘧啶甲基化變異位點統計Table5 Total/half DNA methylation on different development stages of ISSR

圖3 引物分別在山核桃幼胚發育的5個時期材料中的擴增結果Figure3 Amplification results of immature embryos in five development stages by different ISSR primers

[1]郭傳友，黃堅欽，方炎明.山核桃研究綜述及展望[J].經濟林研究， 2004， 22（1）： 61-63.GUO Chuanyou，HUANG Jianqin，FANG Yanming.Review and perspective of research on Carya cathayensis [J].Nonwood For Res，2004， 22（1）： 61-63.

[2]張婷，張虹.山核桃青皮化學成分及生物活性研究進展[J].食品科技， 2007（5）： 116-119.ZHANG Ting，ZHANG Hong.Research progress on chemical compounds of the green peel of Carya cathayensis Sarg.and its biological activity [J].Food Sci Technol， 2007（5）： 116-119.

[3]ZHANG Qixiang,HU Henkang， HUANG Jianqin， et al.Somatic embryogenesis and plant regenerationfromimmature hickory（CaryacathayensisSarg.） embryos[J].PropOrnamPlants， 2011， 11（3）： 137-143.

[4]張啟香，胡恒康，王正加，等.山核桃間接體細胞胚發生和植株再生[J].園藝學報，2011，38（6）： 1063-1070.ZHANG Qixiang， HU Hengkang， WANG Zhengjia， et al.Indirect somatic embryogenesis and plant regeneration of Carya cathayensis [J].Acta Hortic Sin， 2011， 38（6）： 1063-1070.

[5]RUSSO V E A， MARTIENSSEN R A， RIGGS A D.Epigenetics Mechanisms of Gene Regulation [M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996.

[6]ZHANG Meishan， KIMATU J N， XU Kezhang， et al.DNA cytosine methylation in plant development[J].Genet Genomics， 2010， 37： 112.

[7]GEHRING M， HENIKOFF S.DNA methylation dynamics in plant genomes [J].Biochim Biophys Acta， 2007， 1769（5/6）： 276-286.

[8]ZHANG Qixiang， HU Hengkang， HUANG Youjun， et al.The relationship between developmental stages of zygotic embryos at explanting and embryogenic frequency on hickory （Carya cathayensis Sarg.）[J].Sci Hortic， 2012， 139：66-70.

[9]POREBSKI S， BAILEY L G， BAUM B R.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components [J].Plant Mol Biol Rep， 1997， 15（1）： 8-15.

[10]李元春，沈林，曾燕如.山核桃SRAP體系的建立基及與RAPD和ISSR標記的比較[J].浙江農林大學學報，2011， 28（3）： 505-512.LI Yuanchun， SHEN Lin， ZENG Yanru.Establishment of a SRAP analysis protocol in Carya cathayensis and a comparison among SRAP， RAPD， ISSR analysis protocols [J].J Zhejiang A&F Univ， 2011， 28（3）： 505-512.

[11]邱英雄，胡紹慶，陳躍磊，等.ISSR-PCR技術在桂花品種分類中的應用[J].園藝學報，2004，31（4）：529-532.QIU Yingxiong， HU Shaoqing， CHEN Yuelei， et al.Studies on cultivar classification of Osmanthus fragrans by ISSR-PCR analysis [J].Acta Hortic Sin， 2004， 31（4）： 529-532.

[12]XU Mingliang， LI Xiangqian， SCHUYLER S.AFLPbased detection of DNA methylation plant [J].Plant Mol Biol Rep， 2000， 18（4）： 361-368.

[13]FINNEGAN E J， BRETTELL R I， DENNIS E S.The role of DNA methylation in the regulation of plant gene expression [J].EXS， 1993， 64： 218-261.

[14]RICHARDS E J.DNA methylation and plant development[J].Trends Genet， 1997， 13（8）： 319-323.

[15]CHEN Taiping， LI En.Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases [J].Curr Top Dev Biol，2004,60：55-89.

[16]PAN Yajiao， WANG Wensheng， ZHAO Xiuqin， et al.DNA methylation alterations of rice in response to cold stress [J].Plant Om J， 2011， 4（7）： 364-369.

[17]OU Xiufang， LONG Likun， ZHANG Ying， et al.Spaceflight induces both transient and heritable alterations in DNA methylation and gene expression in rice （Oryza sativa L.） [J].Mutation Res， 2009，662（1/2） ： 44-53.

[18]JASENCAKOVA Z， SOPPE W J， MEISTER A， et al.Histone modifications in Arabidopsis high methylation of H3 lysine 9 is dispensable for constitutive heterochromatin [J].Plant J， 2003， 33（3）： 471-480.

[19]ZHANG Jian， NALLAMILLI B R， MUJAHID H， et al.OsMADS6 plays an essential role in endosperm nutrient accumulation and is subject to epigenetic regulation in rice （ Oryza sativa）[J].Plant J， 2010， 64（4）： 604-617.

[20]CAO Xiaofeng， JACOBSEN S E.Role of the Arabidopsis DRM methyltransferases in de novo DNA methylation and gene silencing [J].Curr Biol， 2002， 12（13）： 1138-1144.

[21]PORTIS E， ACQUADRO A， COMINO C， et al.Analysis of DNA methylation during germination of pepper（Capsicum annuum L.） seeds using methylation-sensitive amplification polymorphism （MSAP）[J].Plant Sci， 2004， 166（1）： 169-178.