草魚腸道纖維素降解細(xì)菌的分離與鑒定

王微微 吳山功 鄒 紅 鄭英珍 程瑩寅 王桂堂

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草魚腸道纖維素降解細(xì)菌的分離與鑒定

王微微1, 2吳山功1鄒 紅1鄭英珍1, 2程瑩寅1王桂堂1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

為更好地弄清草魚()腸道纖維素降解細(xì)菌的種類, 采用羧甲基纖維素(CMC)作為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基, 分別從草魚腸道內(nèi)容物和腸道黏膜中分離到了40株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌。16S rRNA基因序列的分析結(jié)果顯示, 大多數(shù)產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌為氣單胞菌屬()的種類, 其次為腸桿菌屬()的細(xì)菌以及未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium)。進(jìn)一步研究細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶能力發(fā)現(xiàn), 纖維素酶活性顯著性高于其他菌株的分別是MC2、BC6、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中一種未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細(xì)菌BM3(Uncultured bacterium BM3)和HC9。草魚腸道中簡答氣單胞菌()、類志賀鄰單胞菌()、陰溝腸桿菌()以及產(chǎn)氣腸桿菌()是被作為產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的首次報道。

草魚; 腸道; 內(nèi)容物; 黏膜; 纖維素降解細(xì)菌

草魚()是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的一個品種(ftp://ftp.fao.org/fi/stat/summary/ a-6.pdf), 2009年我國的草魚養(yǎng)殖產(chǎn)量是4.08×109kg, 占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的21.4%[1]。草魚是典型的草食性動物, 以水草為食, 日攝食率可以達(dá)到49.9%[2]。高攝食率會導(dǎo)致草魚的消化不完全, 在糞便中甚至可以檢查到未被消化的完整植物葉片[3]。然而, 纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分。目前的研究表明, 細(xì)菌、真菌、原生動物、昆蟲和軟體動物等均能夠產(chǎn)生纖維素酶(Cellulase)[4—8]。植食性動物尤其是高等動物, 自身并不產(chǎn)生纖維素酶[9], 而是依賴其消化道共生生物, 如細(xì)菌、真菌和原生動物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素[10]。在魚類的消化酶研究中也發(fā)現(xiàn)了其消化道內(nèi)存在纖維素酶, 一般認(rèn)為這些纖維素酶是由其消化道內(nèi)細(xì)菌分泌的[11]。因此, 篩選高效纖維素降解細(xì)菌, 并將其添加到飼料中提高草魚對纖維素食物的消化利用率, 則對促進(jìn)草魚的生長、降低飼料對水環(huán)境的污染尤為重要。

目前, 對草魚纖維素降解細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn), 弧菌()、氣單胞菌()和芽孢桿菌()是草魚腸道中重要的纖維素降解細(xì)菌[12, 13, 14]。此外, 厭氧芽孢桿菌()、明串珠菌()、梭菌()、放線菌()和檸檬酸桿菌()也被推測為草魚腸道中主要的纖維素降解細(xì)菌[15]。但是, 這些研究僅分析了草魚腸道內(nèi)容物或者腸道黏膜的細(xì)菌, 尚未有研究將內(nèi)容物與腸道黏膜的細(xì)菌結(jié)合起來分析。

本研究以草魚腸道內(nèi)容物以及腸道黏膜為研究對象, 旨在通過對草魚腸道內(nèi)容物以及黏膜纖維素降解細(xì)菌的綜合研究, 為草魚腸道產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的研究提供了新思路。實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)了草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌, 并測定了其纖維素酶活性, 以期篩選出具有較高纖維素酶活性的細(xì)菌, 從而為草魚飼料工業(yè), 乃至我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)魚為三齡草魚, 取自湖北省石首市老河長江“四大家魚”國家級原種場, 共5尾。實(shí)驗(yàn)魚投喂的配合飼料中, 粗纖維比不高于12%。

按無菌方法操作, 即用75%酒精棉球擦拭草魚體表3次, 于無菌操作臺上, 分出草魚的前腸、中腸、后腸, 并參考Ring? ,.[16]的方法分別取不同腸段的內(nèi)容物以及腸黏膜, 并按照不同腸段將5尾魚的腸道內(nèi)容物和腸黏膜分別混合。

1.2 細(xì)菌分離和純化

以無菌方式, 分別稱取1g的草魚各個腸段的內(nèi)容物和黏膜, 充分勻漿, 按照10倍梯度稀釋法稀釋成一系列梯度。采用稀釋涂布平板法, 選取三個連續(xù)的合適稀釋度, 吸取0.1 mL稀釋液涂布于羧甲基纖維素(CMC)選擇培養(yǎng)基(羧甲基纖維素 10 g/L, KH2PO44 g/L, Na2HPO44 g/L, MgSO4×7H2O 0.2 g/L, CaCl20.001 g/L, FeSO4×7H2O 0.004 g/L, 胰蛋白胨 2 g/L, 瓊脂粉 15 g/L)平板上, 置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48h。然后, 采用平板劃線分離法, 從平板上隨機(jī)挑選清晰、分散良好的細(xì)菌菌落, 在CMC平板上連續(xù)劃線培養(yǎng)三次以純化細(xì)菌。

1.3 細(xì)菌的分型

細(xì)菌基因組DNA的提取采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取細(xì)菌基因組DNA, 具體方法參見試劑盒說明書。

ERIC-PCR引物及反應(yīng)條件細(xì)菌ERIC擴(kuò)增引物由北京華大基因研究中心合成, 引物序列分別為: ERIC1R: 5￠-TGTAAGCTCCTGGGGATTCAC -3￠; ERIC2: 5￠-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG -3￠[17]。ERIC-PCR反應(yīng)體系(終體積25 μL): 20 ng DNA, 0.8 μmol/L 引物, 0.2 mmol/L dNTP, 1 × Ex緩沖液, 1U ExDNA聚合酶, 無菌超純水補(bǔ)足到25 μL。ERIC-PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性1min, 32℃退火1min, 72℃延伸2min, 運(yùn)行5個循環(huán); 94℃變性30s, 48℃退火30s, 72℃延伸1min, 運(yùn)行40個循環(huán); 72℃延伸10min。

ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂140V電泳1h后, 于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察瓊脂糖凝膠電泳譜帶, 依據(jù)PCR產(chǎn)物的條帶分布情況對細(xì)菌進(jìn)行分型。

1.4 細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶活性大小的鑒定以及統(tǒng)計分析

將純化的細(xì)菌菌落用牙簽點(diǎn)種于CMC培養(yǎng)基平板上, 置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48h, 每個菌株做三個平行。參照Teather和Wood[18]的方法, 在CMC培養(yǎng)基平板中加入剛果紅溶液進(jìn)行染色。在染色結(jié)束后, 測量水解圈的直徑()以及菌落的直徑(), 并以水解圈直徑與菌落直徑之比(/)的大小為參考依據(jù), 判斷細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的能力, 即比值越大, 表示該菌株的產(chǎn)纖維素酶的能力越大; 反之越小。

將水解圈直徑與菌落直徑比()的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理之后, 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.5 16S rRNA基因序列分析法鑒定

16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增 以細(xì)菌DNA為模板, 采用細(xì)菌通用引物27F (5￠-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3￠)和1492R (5￠-TACG GTTACCTTGTTACGACTT-3￠), 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列。引物由北京華大基因研究中心合成。PCR反應(yīng)體系(終體積50 μL): 40 ng DNA, 0.2 μmol/L 引物, 0.2 mmol/L dNTP, 1 × Ex緩沖液, 1.5 U ExDNA聚合酶, 無菌超純水補(bǔ)足到50 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性4min; 94℃變性30s, 53℃退火30s, 72℃延伸1min30s, 運(yùn)行35個循環(huán); 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析, 然后采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化, 具體方法參見試劑盒說明書。

16S rRNA 基因序列的克隆 將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa, 中國大連), 構(gòu)建重組質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌()TOP10感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布于含有氨芐青霉素 (100 mg/L)的LB培養(yǎng)基平板上, 37℃培養(yǎng)10h后, 隨機(jī)挑選幾個克隆。采用插入片段的擴(kuò)增引物27F/1492R檢測質(zhì)粒載體中插入片段的長度, 從插入正確長度片段的克隆中挑選一個克隆送北京華大基因研究中心測序。

序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 細(xì)菌的測序結(jié)果經(jīng)過拼接以及去載體序列后, 與GenBank上的已有序列進(jìn)行同源性比對分析, 檢索最近似的微生物序列。利用Cluster W軟件對測序所得序列和其最相似的微生物序列進(jìn)行多重序列比對, 然后在MEGA 4.0 軟件中, 根據(jù)Kimura 2-parameter model遺傳距離模型, 使用鄰接法(neighbour-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

2 結(jié)果

2.1 草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離

基于羧甲基纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基, 分別從草魚的前、中、后腸的內(nèi)容物和黏膜中分離到了40株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌(表1)。進(jìn)一步的ERIC- PCR分型顯示, 這些細(xì)菌分為10種類型。其中, 草魚前腸內(nèi)容物分離的菌株包括了2種類型、黏膜包括1種類型, 中腸內(nèi)容物1種、黏膜2種, 后腸內(nèi)容物和黏膜分離的菌株都包括了2種類型(表1)。

2.2 草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的產(chǎn)酶能力大小分析

將草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的不同ERIC基因型的代表菌株接種于CMC培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)和剛果紅染色, 并測量菌株產(chǎn)水解圈的直徑和自身菌落直徑。結(jié)果顯示, 這些菌株的水解圈直徑大小在(0.37±0.06) cm到(2.43±0.15) cm之間(表2),而水解圈直徑和菌落直徑比值的范圍為1.78±0.03到6.30±3.06。其中,/比值大于5的菌株有MC2、BC6、BM3和HC9, 均顯著地大于其他細(xì)菌的/比值(表2)。

表1 草魚腸道中分離的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌數(shù)量及其ERIC分型結(jié)果

表2 草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的降解能力(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)*

注:*同列數(shù)據(jù)后不同上標(biāo)英文字母表示差異顯著(<0.05)

Note:*Means in the same column with different superscripts indicate significantly different (<0.05)

2.3 草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

將產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的不同ERIC基因型中代表性菌株的序列, 通過Blast程序進(jìn)行檢索, 得到與這些菌株最相似的細(xì)菌種類。比對結(jié)果顯示, 除了BM3之外, 其他的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的最同源序列均能夠鑒定到種, 并且與已知種類細(xì)菌的16S rRNA基因序列相似性達(dá)到了99%或100%(表3)。

在草魚腸道中分離的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌包括了氣單胞菌屬()和腸桿菌屬()的種類以及未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium)(表3)。氣單胞菌種類所占的比例最高, 為85%, 包括: 威隆氣單胞菌()(47.5%)、簡答氣單胞菌()(32.5%)和嗜水氣單胞菌()(5%)。進(jìn)一步分析了不同產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌在草魚不同腸段的內(nèi)容物和黏膜中的組成比例, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 威隆氣單胞菌在草魚中腸內(nèi)容物、后腸內(nèi)容物和黏膜中, 占有很高的比例, 分別是100%(MC)、81.82%(BC)和60%(BM)。簡答氣單胞菌在草魚前腸內(nèi)容物和中腸黏膜中占有很高的比例, 分別是71.43%(HC)和88.89%(MM)。在草魚前腸黏膜(HM)中, 分離到的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌全部是類志賀鄰單胞菌()。

表3 草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的16S rRNA序列分析

在分離的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌中, 菌株BM3為一株未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured baterium)(表3)。根據(jù)本研究的細(xì)菌16S rRNA基因序列以及與其最同源的序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果顯示, BM3與腸桿菌屬()的細(xì)菌種類較為相近(圖1)。

3 討論

隨著對魚類腸道微生物研究的深入, 越來越多的關(guān)注點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)向消化代謝相關(guān)的功能微生物。在魚類腸道中, 微生物可以分泌包括纖維素酶在內(nèi)的消化酶, 參與宿主的營養(yǎng)與生理過程。草魚作為一種草食性魚類, 纖維素是其攝入的主要成分, 而魚類自身不能夠分泌纖維素酶[20, 21], 因此, 草魚需要依靠腸道中能降解纖維素的細(xì)菌來輔助其消化纖維素提供營養(yǎng)。本研究通過羧甲基纖維素選擇性培養(yǎng)基的篩選以及基于16S rRNA基因序列的測序方法, 從池塘養(yǎng)殖的草魚腸道中分離并鑒定了幾株能夠產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌。

一般認(rèn)為, 在腸道黏膜上定植的細(xì)菌是腸道內(nèi)的固有菌群(Autochthonous), 而腸道內(nèi)容物中的細(xì)菌則為暫住菌群(Allochthonous)[22]。已有的研究均從草魚腸道黏膜中分離到了產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌[12, 14, 23]; 也有研究從草魚腸道內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)了纖維素降解細(xì)菌[15], 這說明纖維素降解細(xì)菌廣泛存在于草魚腸道中。

圖1 基于草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(比例尺為0.02, 表示遺傳距離)

本研究從草魚腸道中分離的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌以氣單胞菌()為主, 這與馮雪等[13]和Jiang,.[14]對草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的研究結(jié)果是一致的。在本研究中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶氣單胞菌, 包括了威隆氣單胞菌()、嗜水氣單胞菌()以及簡答氣單胞菌()三個種類。其中, 在水解圈直徑與菌落直徑的比值大于5.0的氣單胞菌種類中, 以威隆氣單胞菌(MC2, BC6)為主, 其次是簡答氣單胞菌(HC9), 這與Jiang,.[14]的結(jié)果類似, 他們在研究草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌時也發(fā)現(xiàn)威隆氣單胞菌的水解圈直徑與菌落直徑的比值大于5.0, 其次是嗜水氣單胞菌。較以往對草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的研究而言, 本研究在草魚腸道中發(fā)現(xiàn)了更多的具有產(chǎn)纖維素酶能力氣單胞菌, 如簡答氣單胞菌。氣單胞菌是草魚腸道中的優(yōu)勢菌群之一[24], 長期以來, 這類細(xì)菌多被報道為草魚細(xì)菌性疾病的病原菌[25]。然而, 近幾年在對草魚腸道細(xì)菌多樣性和細(xì)菌功能的研究中, 發(fā)現(xiàn)氣單胞菌具有產(chǎn)木聚糖酶和纖維素酶的能力[14, 26]。結(jié)合本研究的結(jié)果, 說明腸道中氣單胞菌并非僅作為條件致病菌存在, 它們也可能在魚類生物學(xué)(Fish biology)中, 尤其是協(xié)助宿主水解纖維素方面發(fā)揮了重要作用[27, 28]。因此, 需要深入地研究氣單胞菌在草魚腸道中發(fā)揮的生物學(xué)功能。

本研究還在草魚腸道中分離到了腸桿菌屬()的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌。腸桿菌是淡水魚類腸道中常見的兼性厭氧細(xì)菌[29], 已報道的草魚腸道中產(chǎn)纖維素酶的腸桿菌有阿氏腸桿菌()[30]。本研究在草魚腸道中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶腸桿菌的種類有陰溝腸桿菌()和產(chǎn)氣腸桿菌(), 以及在系統(tǒng)發(fā)育樹中與腸桿菌屬種類關(guān)系較近的一種未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細(xì)菌BM3(Uncultured bacterium)。盡管陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌已經(jīng)被證明具有降解纖維素產(chǎn)氫氣的能力[31, 32], 但是其在草魚腸道中還是首次報道。此外, 在草魚腸道中還分離到了具有分解纖維素能力的類志賀鄰單胞菌()。類志賀鄰單胞菌, 主要存在于自然界的水體和土壤中, 也見于魚和其他水生動物的腸道中。本研究是首次報道了草魚腸道的類志賀鄰單胞菌具有降解纖維素的能力。

本研究同時從草魚腸道內(nèi)容物以及黏膜中分離到了多株能夠降解纖維素的細(xì)菌, 并且其中四株細(xì)菌表現(xiàn)出較高的纖維素酶活性。類志賀鄰單胞菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、簡答氣單胞菌以及一種未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細(xì)菌BM3為首次從草魚消化道報道的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌。這些研究結(jié)果豐富了對草魚腸道產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的認(rèn)識, 也為開發(fā)與纖維素降解相關(guān)的益生菌提供了理論參考。本研究以CMC為底物, 僅僅檢驗(yàn)的是細(xì)菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的能力, 而纖維素的水解需要內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶與纖維二糖酶三者的協(xié)同作用, 因此, 對草魚消化道纖維素降解細(xì)菌的全面研究需要針對不同的纖維素酶, 運(yùn)用更多的底物來分析。

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Characterization of cellulose-decomposing bacteria in the intestine of grass carp,(Val.)

WANG Wei-Wei1, 2, WU Shan-Gong1, ZOU Hong1, ZHENG Ying-Zhen1, 2, CHENG Ying-Yin1and WANG Gui-Tang1

(1. The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciences,Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049,China)

The microbiota in the animal digestive tracts plays an important role in the nutrition and metabolism of their host. Many cellulose-ingesting animals need the microorganisms in their digestive tracts for degrading cellulose and therefore providing the energy. For example, cellulose-decomposing bacterial population has been frequently found in the intestine of grass carp (), an herbivore fish species. However, knowledge about this type of bacteria remains unclear. In this study, we characterized the species of the cellulose-decomposing microbiota in the content and mucosa in the intestine of grass carp. We isolated and cultured the cellulolytic bacteria in the foregut, midgut and hindgut of the intestine using the medium with carboxymethycellulose (1%) as its sole carbon source. Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) PCR fingerprint was utilized to identify different genotypes of the isolated bacteria. The cellulose-degrading activity of each strain was indicated by the ratio of the diameter of the clear zone to the diameter of the colony. We identified the genotypes of these bacteria by sequencing the 16S rRNA gene. Forty strains of cellulose-decomposing bacteria from intestinal content and mucosa of grass carp were identified. Two genotypes of the cellulose-decomposing bacteria were discovered in the content of foregut and hindgut, and in the mucosa of midgut and hindgut. Only one genotype of the cellulose-decomposing bacteria was discovered in the mucosa of foregut and midgut. The 16S rRNA sequencing analysis showed that the majority of the cellulolytic bacteria waswhich accounted for 85% of the total bacterial isolates.accounted for 7.5%and the “uncultured bacterium” accounted for 5%. The ability of degrading cellulose varied remarkably among different bacterial strains. High enzymatic activity was observed in some isolates of the cellulose-degrading bacteria. The bacterial isolates with a ratio (the diameter of clearing zone to the diameter of the colony) greater than 5.0 had significantly higher cellulolytic ability than the others. These bacterial isolates were identified as(MC2, BC6), “uncultured bacterium” (BM3) in Enterobacteriaceae, and(HC9). Here we reported that,,andwere cellulose-decomposing bacteria in grass carp intestine for the first time. The results of the present study indicated that there were a variety of cellulose-degrading bacteria in the intestine of grass carp. Our study contributed to the knowledge about cellulolytic bacterial species in the intestine of grass carp, and will provide the guidance for the selection of cellulose-degrading probiotics.

Grass carp; Intestine; Content; Mucosa; Cellulose-decomposing bacteria

2013-01-04;

2013-11-22

國家自然科學(xué)基金面上項目(31272706); 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2009CB118705); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-46-08)資助

王微微(1984—), 女, 河南新鄉(xiāng)人; 博士研究生; 主要從魚類微生物研究。E-mail: wangww1114@163.com

吳山功, E-mail: wusgz@ihb.ac.cn

Q939.1

A

1000-3207(2014)02-0291-07

10.7541/2014.42