重金屬脅迫對刺參胚胎發育的影響

姜會超 劉愛英 宋秀凱 孫國華 劉麗娟

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重金屬脅迫對刺參胚胎發育的影響

姜會超 劉愛英 宋秀凱 孫國華 劉麗娟

(山東省海洋資源與環境研究院, 山東省海洋生態修復重點實驗室, 煙臺 264006)

重金屬; 刺參; 胚胎; LOEC

刺參 () 又稱仿刺參, 隸屬棘皮動物門海參綱楯手目刺參科, 是一種營養和經濟價值很高的海洋無脊椎動物[1, 2]。主要分布于北起俄羅斯的海參崴, 經日本海, 朝鮮半島南到我國黃、渤海以及江蘇連云港外的西北太平洋沿岸[3]。近年來, 隨著人們對刺參高營養價值的認可, 刺參的人工養殖規模不斷擴大, 已成為重要的海水養殖生物。但與此同時, 隨著大量工業污水和生活廢水排放入海, 環境污染尤其是重金屬污染問題尤為突出, 對沿海地區刺參養殖帶來了嚴重危害[4]。有報道稱[5, 6], 渤海灣底質環境質量總指數已達到很強的生態危害, 環境污染指數為: Hg>Cd>Cu>As> Pb>Cr>Zn。馮志權等[7]報道幾種經濟動物體內重金屬殘留量, 發現生物體內Hg、Cd、Cu、As、Pb五種重金屬中只有Hg和Cu符合中華人民共和國國家標準中有關食物限量衛生標準, 其他重金屬嚴重超標[7]。重金屬對海洋生物的毒害在造成重大經濟損失的同時也為人類食品健康安全埋下了隱患。

近年來, 有關重金屬對海洋經濟生物毒性作用的研究以魚蝦類居多[8—11], 關于重金屬對刺參毒性作用的研究, 主要集中在刺參的幼蟲及稚參階段[12, 13], 而有關重金屬對刺參受精卵孵化及胚胎發育的研究較少見報道。由于受精卵及初孵耳狀幼體對環境抵抗力較弱, 對水環境中重金屬含量的變化可能更加敏感。本文從孵化率、畸形率以及胚胎滯育方面探討了鋅、汞、銅、鉛、砷、鎘、鉻七種海水常見重金屬對刺參胚胎的毒性作用, 并推算了重金屬對刺參胚胎孵化抑制率的最低可觀測效用濃度(LOEC), 旨在為刺參繁育和養殖中對水質的要求提供基礎數據, 并為漁業水質標準制定及漁業資源保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

刺參受精卵通過煙臺海益苗業有限公司培育的野生親參于2012年3月8日晚22:00自然產卵獲得, 產卵水溫(20±0.5)℃, 鹽度30.0—30.5, 挑選正常受精的卵用于毒性試驗。所用藥品C4H6O4Zn·2H2O、As2O3、CuSO4·5H2O、Pb(NO3)2、CdCl2·2.5H2O、K2Cr2O7、HgCl2均為分析純。實驗前用蒸餾水將各試驗藥物配制成一定質量濃度的母液(As2O3需先經NaOH溶解, 再經H2SO4中和), 再用同源的過濾海水[水溫(20±0.5)℃, 鹽度30.0—30.5]稀釋成實驗所需各種濃度。

1.2 毒性試驗

采用靜水生物試驗方法[14]用1000 mL的燒杯分別對7種重金屬進行獨立暴露。每種重金屬均設9個濃度組, 濃度梯度的設置主要參照國家漁業水質標準(GB11607-89)(表1), 各濃度組設置3個平行, 另設3個對照組, 對照組為自然海水, 重金屬粒子背景值: Cd 0.000402 mg/L、Cr 0.00014 mg/L、Cu 0.00323 mg/L、Zn 0.0386 mg/L、Hg 0.000065 mg/L, Pb 0.000806 mg/L、As 0.00176 mg/L, 在實驗濃度梯度配制時扣除自然海水背景值的影響。每組放刺參受精卵約200粒。實驗進行48h, 所有組別均加入1%福爾馬林固定, 顯微鏡下觀察并記錄各組刺參耳狀幼體數量、畸形幼體數量及刺參各個不同發育階段胚胎的數量。

表1 重金屬試驗用液濃度

刺參胚胎發育分期: 細胞期(單細胞至256細胞)、囊胚期、原腸期、初耳幼體及小耳幼體。

1.3 數據處理

孵化率=小耳幼體/(細胞期+囊胚期+原腸期+初耳幼體+小耳幼體)×100%;

畸形率=畸形個體/(細胞期+囊胚期+原腸期+初耳幼體+小耳幼體)×100%;

孵化抑制率=(1–孵化率)×100%。

孵化抑制率最低可觀測效應濃度[15](LOEC): 將對照組孵化抑制率的95%置信上限帶入劑量-效應擬合方程, 計算LOEC值。LOEC指引起胚胎孵化率顯著變化的最低效應濃度, 本實驗采取對照組孵化抑制率的95%置信上限為孵化率顯著變化閾值, 即低于此閾值的孵化抑制率在統計學上無法同對照相區分。

胚胎孵化率、畸形率及不同發育階段胚胎所占比例等數據利用Excel及SPSS 13. 0統計軟件進行數據統計, 重金屬與胚胎劑量-效應模型的曲線擬合以及LOEC的計算采用origin7.5軟件。

2 結果

2.1 重金屬對刺參胚胎孵化率和畸形率的影響

在不同重金屬濃度48h脅迫后, 刺參耳狀幼體孵化率與畸形率結果如圖1所示。在0.03和0.06 mg/L兩個Zn2+濃度組, 刺參胚胎孵化率較高, 與對照無明顯差異(>0.05)。在0.12 mg/L濃度組, 刺參孵化率迅速下降到51.3%, 畸形幼蟲為12.3%, 在0.24 mg/L及以上濃度組, 未見小耳幼體孵出, 刺參胚胎畸形幼蟲比例不斷上升, 在Zn2+最高濃度組, 畸形幼蟲比例23.6%。Hg2+與Zn2+類似, 在0.0002及0.0004 mg/L低濃度組, 刺參胚胎均可正常孵化, 且無畸形幼蟲出現。隨著濃度進一步增加, 孵化率開始緩慢下降, 畸形幼蟲比例上升。在0.0064 mg/L濃度組中, 刺參孵化率降為48.5%, 且19.3%刺參胚胎發生畸變。在0.0128 mg/L及以上濃度組, 未見小耳幼體孵出, 在Hg2+最高濃度組, 畸形幼蟲比例32.1%。Cu2+對刺參胚胎影響較大, 在0.005 mg/L低濃度組, 刺身胚胎孵化率為82.0%, 與對照無明顯差異(>0.05), 但伴有少量畸形幼蟲。隨著Cu2+濃度增高, 刺參孵化率迅速下降, 畸形率上升, 在 0.02 mg/L濃度組, 孵化率降為6.5%, 畸形率上升到23.5%, 在0.04 mg/L及以上濃度組, 未見小耳幼體孵出, 在Cu2+最高濃度組, 畸形幼蟲比例42.3%。在As3+最低濃度組(0.03 mg/L)中, 胚胎孵化率(74.6%)略低于對照組(80.3%), 隨著濃度的增加, 孵化率迅速下降, 畸形率不斷上升。在1.92 mg/L濃度組, 刺參胚胎孵化率下降到29.3%, 畸形率為52.3%, 在3.84 mg/L及以上濃度組, 無小耳幼體孵出, 在As3+最高濃度組, 62.3%的刺參胚胎發生畸變。Pb2+對刺參胚胎孵化率影響較大, 對胚胎幼體致畸作用不明顯。在0.02 mg/L濃度組中, 孵化率為79.3%, 隨濃度進一步增加, 孵化率開始下降, 在1.28 mg/L濃度組, 孵化率降為13.5%, 在Pb2+9個濃度組中均未發現畸形幼蟲。Cd2+對刺參孵化率影響較小, 隨濃度增加, 孵化率下降趨勢較為平緩, 在最高濃度組, 孵化率仍可達到54.4%, 且畸形率也維持在較低水平。在暴露濃度范圍內, Cr6+對刺參孵化率無明顯影響, 均保持在70%以上, 在2.56 mg/L最高濃度組, 16.7%胚胎幼體發生畸變。

刺參胚胎畸形主要以受精卵細胞期異變及不規則卵裂為主 (圖2), 其中細胞期異變及不規則卵裂所占總畸形胚胎比例達到74.16% , 而其余畸形現象出現較少, 主要有形態異常, 胚胎萎縮, 消化道未開通等。

圖1 重金屬脅迫下刺參胚胎的孵化率及畸形率

Fig. 1 The embryos hatching rates and malformation rates ofunder heavy metals

2.2 在不同重金屬脅迫下刺參胚胎發育狀況

經48h孵化后, 在不同重金屬濃度脅迫下刺參胚胎各發育階段所占比例如圖3所示。不同重金屬對刺參胚胎發育的影響不同, 隨著重金屬濃度的升高, 刺參胚胎的發育出現明顯地滯育現象。

Zn2+0.03 mg/L濃度組, 刺參胚胎全部孵化為小耳幼體, 與對照組無顯著差異(>0.05), 隨著濃度增加, 小耳幼體比例開始下降, 初耳狀幼體比例上升。在0.24 mg/L濃度組, 無小耳幼體孵出, 71.7%刺參胚胎發育到初耳狀幼體, 原腸期胚胎占28.3%。在0.48 mg/L濃度組, 刺參胚胎出現明顯的滯育, 胚胎全部停留在原腸期, 無耳狀幼體孵出。在0.96 mg/L及以上濃度組, 原腸期胚胎比例大幅下降, 90%以上的胚胎停留在囊胚期。

在Hg2+低濃度組中, 刺參胚胎大部分發育到小耳幼體, 隨Hg2+濃度的增加, 小耳幼體下降趨勢較為緩慢, 在0.0032 mg/L濃度組, 小耳幼體比例69.1%, 初耳狀幼體30.9%。隨著Hg2+濃度進一步升高, 刺參胚胎發育受到明顯延緩, 在0.0064 mg/L濃度組, 原腸期胚胎占60.5%, 小耳幼體及初耳狀幼體的比例分別下降到4.8%、34.7%。在0.0128 mg/L濃度組, 原腸期比例擴大到91.6%, 無小耳幼體孵出。在0.0512 mg/L最高濃度組, 刺參胚胎全部停留在細胞期。

Cu2+對刺參胚胎影響較大, 在0.005 mg/L最低濃度組, 82%刺參胚胎發育到小耳幼體, 與對照組無顯著差異(>0.05)。隨著濃度增加, 小耳幼體比例下降, 初耳狀幼體及原腸期比例上升。在0.04 mg/L濃度組, 胚胎全部發育到原腸期, 無耳狀幼體孵出, 在0.08 mg/L濃度組, 80%刺參胚胎停留在細胞期, 在Cu2+0.16 mg/L及以上濃度組, 刺參胚胎完全停留在細胞期, 仍在進行緩慢地卵裂。

在As3+最低濃度組, 小耳幼體比例68.8%, 較對照組略有下降。隨著As3+濃度增加, 小耳幼體比例不斷下降, 初耳狀幼體及原腸期比例不斷上升。在0.48 mg/L濃度組, 小耳幼體比例下降到45.5%, 初耳狀幼體及原腸期分別上升到48.9%、5.7%。在0.96 mg/L濃度組, 出現少量囊胚期胚胎。在3.84 mg/L濃度組, 無小耳幼體孵出, 原腸期胚胎占59.7%。在7.68 mg/L最高濃度組, 刺參胚胎原腸期、囊胚期、細胞期比例分別為43.7%、23%、33.3%。

在Pb2+0.02 mg/L濃度組, 79.3%刺參胚胎發育到小耳幼體, 隨著濃度增加, 小耳幼體比例不斷下降, 初耳狀幼體比例不斷上升。在1.28 mg/L濃度組, 小耳幼體下降到7.7%, 83.9%刺參胚胎發育到初耳幼體階段。在2.56 mg/L及以上濃度組, 無小耳幼體孵出。

Cd2+對刺參胚胎的發育影響較弱, 在實驗暴露濃度范圍內, 不同胚胎發育階段比例隨濃度變化較小。在1.28 mg/L最高濃度組, 小耳幼體及初耳狀幼體所占比例分別為54.4%、38.1%。原腸期胚胎在不同濃度組之間比例較為穩定, 基本維持在7%左右。

在Cr6+暴露濃度范圍內, 刺參胚胎均發育與對照組無明顯差異(>0.05), 小耳幼體比例未隨Cr6+濃度的增加而降低, 反而在0.16 mg/L濃度組有較小幅度上升。在Cr6+最低與最高濃度組中, 小耳幼體所占比例分別為77.7%、74.3%。

綜上所述, 在本實驗暴露濃度范圍內, Zn2+、Hg2+、Cu2+三種重金屬離子對刺參胚胎的發育影響最大, 隨著離子濃度增加, 刺參胚胎發育受到明顯延緩。其次是As3+和Pb2+離子, Cd2+和Cr6+離子對刺參胚胎發育延緩作用較弱。

2.3 重金屬與刺參胚胎孵化率劑量-效應關系

刺參小耳幼體孵化抑制率與重金屬濃度擬合關系如表2所示, Cr6+在實驗濃度范圍內對刺參胚胎毒性較弱, 隨著離子濃度的增加, 其孵化率未見明顯下降趨勢(圖1)。其他6種重金屬對孵化抑制率影響較為顯著, 劑量-效應關系與所選曲線模型高度擬合(2>0.9), 可以較好地解釋重金屬對刺參胚胎孵化抑制率的影響。

圖2 刺參胚胎發育異常情況

A為正常卵裂期胚胎；B為正常小耳幼體；C為細胞期異變；D、E、F為不規則卵裂；G為形態異常；H為胚胎萎縮；I為消化道為開通

A. normal embryo in cleavagestage; B. normal auricularia; C. metamorphosis in cell stage; D, E, F. anarchial cleavage; G. paramorphia; H. embryoatrophy; I. defective alimentary canal

表2 重金屬與刺參孵化抑制率劑量-效應模型參數

注:為重金屬濃度,為孵化抑制率

Note:represents the heavymetalconcentrations,represents theinhibition rates of embryoshatching

對照組孵化抑制率95%置信區間上限為27.8%, 將其分別代入表2曲線擬合方程, 計算不同重金屬對刺參胚胎孵化抑制率LOEC值(表3)。

圖3 重金屬脅迫下日本對蝦胚胎不同發育階段所占比例

通過曲線擬合方程計算的LOEC與概率單位法得出的LOEC較為接近。Hg2+和Cu2+對刺參胚胎的LOEC值最低, 分別為0.0031、0.0080 mg/L, 說明這兩種重金屬對刺參胚胎毒性最大。其次是Pb2+、As3+、Cd2+、Zn2+四種離子。Cr6+濃度與刺參孵化抑制率擬合度較低, 通過概率單位法計算的LOEC為0.72 mg/L, 遠遠高于其他6種重金屬, 說明Cr6+對刺參胚胎毒性最低。

3 討論

不同重金屬對刺參胚胎毒性存在明顯差異, 在實驗暴露濃度范圍內, Zn2+和Cu2+對刺參胚胎孵化率影響最大。其次是Hg2+、Pb2+、As3+, Cd2+和Cr6+對刺參胚胎孵化率影響最小。Selvakumar,.[16]曾報道過, Zn2+對溞狀幼體的毒性比Cu2+和Cd2+還大, 但本實驗中Zn2+對刺參胚胎孵化毒性大很大一部分原因是由Zn2+濃度梯度設計過高導致的(表1), 結合胚胎孵化抑制率LOEC(表3)可知, 7種重金屬對刺參胚胎孵化抑制率LOEC由小到大為Hg2+

表3 不同重金屬對應的最低可觀測效用濃度及漁業水質標準

重金屬的存在不僅會降低刺參胚胎孵化率, 還會增加胚胎幼體的畸形率并延緩胚胎的發育速度, 且隨著離子濃度的增加, 致畸及滯育的現象越明顯。吳鼎勛等[25]、鄒佩貞等[26]在研究魚類胚胎發育時也發現了同樣的現象。有學者認為胚胎的生長發育, 主要受遺傳因素和環境因子兩方面影響[27]。本實驗對照組正常孵化且無畸形胚胎出現, 可以排除遺傳因素的影響, 因此在本實驗中胚胎的畸形現象主要是由于環境因子即重金屬離子的影響造成的。Huang,.[23, 24]報道過, Hg2+濃度≥20 μg/L或Zn2+濃度≥ 1 mg/L時均會引起胚胎和仔魚孵化率降低, 延遲孵化, 死亡率、畸形率增加, 抑制生長和卵黃囊吸收率。在本實驗中, 在Hg2+6.4 μg/L、Zn2+0.240 mg/L時, 刺參胚胎畸形率已高達19.3%、18.3%, 且胚胎發育速度也受到明顯的延緩, 這可能是有物種的差異引起的, 刺參胚胎可能較仔魚對Hg2+、Zn2+等重金屬更加敏感。有研究表明: 重金屬實驗中胚胎的畸形可能是由于重金屬抑制了胚胎ATP的合成和某些酶的活性, 導致胚胎發育所需的能量供應不足, 最終造成了胚胎發育中器官畸形[28]。由圖3可知, 在Zn2+前4個濃度組胚胎發育受到延緩的程度較輕, 但當濃度增加到0.240 mg/L時胚胎發育受到明顯的滯育, 全部停留在原腸期, 無耳狀幼體孵出, 同樣的情況出現在Cu2+濃度組及Hg2+濃度組, 在Hg2+低濃度組, 刺參胚胎發育延緩的程度并不明顯, 但在Cu2+0.04 mg/L及Hg2+0.0064 mg/L濃度組, 胚胎發育出現明顯的滯育, 分別有100%及60.5%的胚胎停留在原腸期, 可見Zn2+、Cu2+、Hg2+離子對胚胎發育的延緩可能存在一個閾值, 在一定范圍內, 重金屬對胚胎發育產生的滯育作用并不明顯, 但一旦超過閾值, 滯育作用則會變得極其顯著, 但同樣的現象并未出現在Pb2+、As3+、Cd2+實驗組, 由圖3可知, 隨著離子濃度的增加, 胚胎發育所受的滯育程度也在平緩的增加, 未見有明顯的閾值。胚胎發育的延緩主要受兩方面的影響: 一方面在胚胎發育階段, 由于有毒物質的作用會致使胚胎的正常發育受阻而被迫中斷, 最終延遲胚胎發育時間[29, 30]。另一方面, 在胚體出膜階段, 由于重金屬離子的存在可能會導致胚體運動能力下降或破壞胚胎孵化酶的作用機制[31, 32], 最終使得胚胎破膜時間和胚胎發育的時間延長。

本實驗發現, 通過曲線擬合與概率單位兩種方法計算的刺參胚胎孵化抑制率最低可觀測效用濃度值(LOEC)雖然略有差異, 但基本在同一數量級上, 說明本文選取的曲線擬合方程可以合理的反應刺參胚胎孵化抑制率隨重金屬濃度梯度的變化趨勢。Cd2+、Hg2+、Cr6+對刺參胚胎孵化抑制率LOEC均高于漁業水質標準, 即現行漁業水質標準對這3種重金屬離子的限量要求在安全值內, 可以保證刺參胚胎的健康發育, 但Cu2+、As3+、Zn2+、Pb2+對胚胎孵化抑制率LOEC已明顯低于漁業水質標準, 現行漁業水質標準能否保證刺參胚胎的健康發育令人擔憂, 在實際漁業生產中應重點加強對此類離子的監控。

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THE TOXIC EFFECTS OF HEAVY METALS ON THE EMBRYONIC DEVE-LOPMENT OF

JIANG Hui-Chao, LIU Ai-Ying, SONG Xiu-Kai, SUN Guo-Hua and LIU Li-Juan

(Shandong Marine Fisheries Research Institute, Yantai 264006,China)

Heavy metal;; Embryos; LOEC

2013-02-21;

2013-11-28

山東省科技發展計劃項目(2009GG10009044);煙臺市科技發展計劃項目(2011457); 水生動物營養與飼料“泰山學者”崗位資助

姜會超(1984—), 男, 山東煙臺人; 碩士; 主要從事海洋生態毒理研究。E-mail: jianghuichao2008@163.com

劉愛英, E-mail: aiyingl@163.com

X171.5

A

1000-3207(2014)02-0393-08

10.7541/2014.56