酵母細胞壁多糖和硫化氫對羅氏沼蝦3種免疫酶活性的影響

許燕余靜王芳張丹鳳

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酵母細胞壁多糖和硫化氫對羅氏沼蝦3種免疫酶活性的影響

許 燕余 靜王 芳 張丹鳳

(上海師范大學生命與環境科學學院, 上海 200234)

酵母細胞壁多糖; 硫化氫; 羅氏沼蝦; ACP; POD; PPO

蝦類病害是嚴重影響蝦類養殖業發展的一個重要因素, 而蝦類疾病的發生與養殖水體環境的惡化有明顯的關系[1, 2], 因此重視水體生態環境質量, 關注環境因子對蝦蟹類非特異性免疫的影響, 已成為新的研究熱點[3, 4]。硫化氫是水產動物養殖水體中常見的有毒害作用的物質, 也是一個重要的監測養殖水環境的化學指標, 硫化氫污染會導致蝦類免疫力降低和疾病的發生, 研究表明養殖水體的硫化氫濃度達0.15 mg/L時, 即會引起導致羅氏沼蝦免疫功能明顯下降[5]。酵母細胞壁多糖能夠誘導機體產生體液免疫和細胞免疫, 已被證明是一種有效的水產類養殖動物免疫增強劑。已有的研究表明采取投喂、浸浴或注射酵母細胞壁多糖的辦法可以提高蝦等水產養殖動物的免疫抗病能力[6, 7]。那么, 在一定濃度H2S污染存在的情況下酵母細胞壁多糖是否還能繼續有效地發揮其免疫增強劑的作用呢？有關這方面的研究還未見報道。

本研究以酸性磷酸酶(Acid phosphatase , ACP)、過氧化物酶(Peroxidase, POD)、酚氧化酶(Phenoloxidase, PPO)這三種重要的對蝦免疫酶[7, 8]為指標, 研究分析酵母細胞壁多糖浸浴處理對羅氏沼蝦()體內肝臟和鰓組織中這3種免疫酶活力的影響, 并分別研究了在一定濃度H2S (0.15mg/L)污染存在的情況下, 預先經過酵母細胞壁多糖浸浴的和未經酵母細胞壁多糖浸浴的羅氏沼蝦體內肝臟和鰓等2種組織中ACP、POD、PPO酶活力的變化, 目的是研究酵母細胞壁多糖和H2S這2種環境因子交互作用對養殖蝦類免疫功能的影響, 為進一步研究蝦類生態養殖水體環境的調控及病害免疫防治提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的羅氏沼蝦購自上海市徐匯區冠生園路漕河涇菜市場, 體色正常, 健康活潑。選擇體長10—12 cm、體重約為12—16 g的個體。

酵母細胞壁多糖由湖北省安琪酵母有限公司提供。該產品中主要成分為β-葡聚糖≥20%、α-甘露聚糖肽≥20%、幾丁質≥2.0%、肽類及蛋白質≥30%。(產品批號: 20100601008)

1.2 實驗蝦分組與處理

將實驗蝦在聚乙烯水簇箱(長×寬×高＝58 cm×43 cm× 39 cm)中暫養2d后, 先分成2組, 每組20尾。1組為對照組飼養在不添加任何成分的養殖水體中, 編號為A; 另一組水體中添加酵母細胞壁多糖(濃度為125 mg/L)[9], 編號為B。水溫 20—25℃, pH 7.3±0.2, 自然光照, 連續充氣。每天8: 00和17: 00各投餌一次, 換水 1/3, 用虹吸法去除排泄物和多余餌料。飼養96h后, 從上面A、B組中各取出10尾蝦及其養殖水體于另外2個水族箱, 分別編號為C、D, 再分別加入0.1 g/L硫化鈉母液至水體中硫化氫濃度為0.15 mg/L, 12h后分別從編號為A、B、C、D的4組中取樣。即A組(純水浸浴108h)、B組(125 mg/L酵母細胞壁多糖水溶液浸浴108h)、C組(純水浸浴96h + 0.15 mg/L H2S水溶液浸12h)、D組(125 mg/L酵母細胞壁多糖水溶液浸浴96h+0.15 mg/L H2S水溶液浸12h)。每一處理組設3 個平行。

1.3 取樣

按上述處理方式飼養4組實驗蝦108h后, 從編號為A、B、C、D的各處理組取8尾沼蝦迅速放入冰盤內解剖, 分別取蝦的肝臟、鰓2種組織, 將濾紙吸干組織上的液體后稱重, 并按1︰9 (/)比例加入預冷的提取液(0.1 mol/L pH 7.0 PBS), 于冰浴中用玻璃勻漿器勻漿。勻漿后經12000 r/min, 4℃條件下離心30min, 取上清液作為粗酶液, 用于酶活的測定。

1.4 樣品分析

磷酸苯二鈉法[10]測定ACP酶活力, 0.9 mL 0.1 mol/L的醋酸緩沖液(pH 4.5)加入1 mL 0.01 mol/L對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)中, 37℃預熱5min, 然后加入0.1 mL酶液, 混勻后于37℃保溫15min, 用2.0 mL 0.1 mol/L的NaOH終止反應。以每100 mL樣品在37℃水浴中與底物作用60min, 產生1.0 mg酚者為一個活力單位(U)。

愈創木酚法[11, 12]測定POD酶活力, 50 mL 0.1 mol/L 的PBS (pH 7.0)中加入19 μL 30%的雙氧水和28 μL的愈創木酚制成反應液, 取3 mL反應液與1 mL酶液混勻后, 測定470 nm的光吸收值。每隔1min測定一次, 測定15min。以每分鐘內光密度變化0.01為1個POD活力單位。計算公式如下: POD總活性＝D470×樣品液總體積/(0.01×反應酶液體積×反應時間×鮮重)。

參照Ashida[13]和昌鳴先等[14]方法測定PPO酶活力, 以0.01 mol/L L-DOPA為特異性底物, 將3 mL 0.1 mol/L 磷酸鉀鹽緩沖液(pH 6.0)與0.1 mL待測酶液及0.1 mL底物于28℃恒溫水浴中混勻, 每隔2min測定490 nm的光吸收值, 測定15min。以試驗條件下每分鐘內光吸收值變化0.001記作為1個PPO酶活力單位。

1.5 數據處理

試驗結果用平均數±標準差表示, 使用 SPSS 13.0分析軟件對數據進行單因素方差分析, Duncan’s 法進行多重比較, 檢驗處理間的差異顯著性,<0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 酵母細胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦鰓、肝臟中ACP酶活力的作用

由表1可知, 對照組(A組)羅氏沼蝦鰓和肝臟中ACP酶活力差別不大, 經125 mg/L酵母細胞壁多糖浸浴108h處理后, 實驗B組蝦體內鰓和肝臟中ACP酶活力明顯提高, 且均與對照組有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中ACP酶活力增加最高達(22.759±0.787) U/mL。這說明 125 mg/L酵母細胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中ACP酶活力。

表1 酵母細胞壁多糖和硫化氫作用下羅氏沼蝦的ACP酶活力(Mean±SD)

注: 上標字母 a者表示與A組有顯著差異 (<0.05), 上標字母b表示與C組有顯著差異(<0.05) ; 下同

Note: The same column with superscripts a means significant differences in activity in comparison with the control in the same array (<0.05), with b means significant differences in activity in comparison with the C in the same array (<0.05); the same applies bellow

純水浸浴96h后, 加入0.15 mg/L H2S浸浴12h后, 與對照組相比, 實驗C組蝦體內鰓中ACP酶活力明顯下降, 且與對照組有顯著差異 (<0.05), 但是肝臟中ACP酶活力卻明顯提高(<0.05)。這表明0.15 mg/L H2S能明顯降低羅氏沼蝦鰓中ACP酶活力。

125 mg/L酵母細胞壁多糖浸浴96h后, 再加入 0.15 mg/L H2S浸浴12h后, 實驗D組蝦體內鰓和肝臟中ACP酶活力與沒有浸浴過H2S的B組相比基本沒有差異, 即與B組的ACP酶活力大小近似, 仍明顯高于對照組(<0.05); 而與未經酵母細胞壁多糖浸浴的C組相比, 則顯著差異(<0.05), 即D組肝臟和鰓組織中的ACP酶活力均顯著大于C組。這表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中ACP酶活力。

2.2 酵母細胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦鰓、肝臟中POD酶活力的作用

表2顯示羅氏沼蝦肝臟中的POD酶活力比鰓中的強。經酵母細胞壁多糖浸浴處理后, B組蝦體內鰓和肝臟中POD酶活力明顯提高, 且均與對照組(A)有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中POD酶活力增加更明顯, 增達(19.521±0.687) U/mL。結果表明酵母細胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中POD酶活力。

純水浸浴96h后, 加入0.15 mg/L H2S浸浴12h后, 與對照組相比, C組蝦體內鰓中POD酶活力明顯下降, 且與對照組有顯著差異 (<0.05), 但是肝臟中POD酶活力卻明顯提高(<0.05)。結果表明0.15 mg/L H2S能明顯降低羅氏沼蝦鰓中POD酶活力。

酵母細胞壁多糖浸浴96h后, 再加入H2S浸浴12h后, 蝦體內鰓和肝臟中POD酶活力變化有差異。D組蝦體內鰓和肝臟中POD酶活力與沒有H2S的實驗B組相比雖然有明顯下降, 但仍明顯高于對照組(<0.05); 而與未經酵母細胞壁多糖浸浴的C組相比, 則實驗D組鰓中的POD酶活力明顯大于C組, 顯著差異(<0.05), 但是肝臟中的POD酶活力與C組相比卻差異不顯著。結果表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓中的POD酶活力。

表2 酵母細胞壁多糖和硫化氫作用下羅氏沼蝦的POD酶活力(Mean ±SD)

2.3 酵母細胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦鰓、肝臟中PPO酶活力的作用

由表3可知, 羅氏沼蝦肝臟中的PPO酶活力比鰓中的強, 經酵母細胞壁多糖和H2S單獨或共同浸浴處理后, 各實驗組羅氏沼蝦鰓和肝臟組織中的PPO酶活力均發生了變化。經酵母細胞壁多糖浸浴處理后, B組蝦體內鰓和肝臟中PPO酶活力明顯提高, 且均與對照組有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中PPO酶活力增加更明顯, 增加為(7.967±0.462) U/mL。這表明酵母細胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中PPO酶活力。而經H2S浸浴處理后, C組蝦體內鰓和肝臟中PPO酶活力明顯下降, 且均與對照組有顯著差異 (<0.05), 尤其是肝臟中PPO酶活力下降更加明顯。結果表明0.15 mg/L H2S能明顯降低羅氏沼蝦肝臟和鰓中PPO酶活力。在經酵母細胞壁多糖浸浴96h后, 再加入H2S浸浴12h后, D組蝦體內鰓和肝臟中PPO酶活力與沒有浸浴過H2S的B組相比基本沒有差異, 仍明顯高于對照組(<0.05); 而與未經酵母細胞壁多糖浸浴的C組相比, 則顯著差異(<0.05), 即實驗D組肝臟和鰓組織中的PPO酶活力均顯著大于C組。結果表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓和肝臟中PPO酶活力。

表3 酵母細胞壁多糖和硫化氫作用下羅氏沼蝦的PPO酶活力(Mean±SD)

3 討論

近年來國內外已經開始從分子水平對蝦類自身的防御機制展開研究, 蝦類的一些免疫抗病相關因子已被研究, 已知蝦體內存在眾多的抗病因子(如各種水解酶類、氧化酶類、溶菌酶、酶激活劑、酶抑制劑、細胞因子、抗菌肽、溶血素、凝集素等), 它們具有相當的抗病能力[7, 8]。在蝦類免疫系統中, ACP、POD和PPO占有重要的地位。PPO在蝦類防御體外物質入侵過程中, 伴隨顆粒細胞的脫顆粒和酚氧化酶原的激活被釋放, 酶活化后可以迅速黏附到異物表面, 以便達到識別和調理的功能[14]。ACP在甲殼動物體內作為巨噬細胞內溶酶體的標志酶, 是溶酶體的重要組成部分, 在血細胞進行吞噬和包囊反應中, 會伴隨有酸性磷酸酶的釋放, 可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞或降解[7]。POD可以有效清除代謝活動中所產生的活性氧等毒性物質, 減輕其對細胞的損傷, 從而提高機體的機體防御和解毒功能[7]。因此不少學者認為ACP、POD和PPO酶活力是判斷蝦類機體免疫能力的指標之一。

本研究通過對不同實驗處理組蝦體鰓和肝臟組織中ACP、POD、PPO 3種免疫相關酶活性的分析比較, 初步分析了酵母細胞壁多糖和H2S對羅氏沼蝦免疫系統的影響。實驗結果表明, 經125 mg/L的酵母細胞壁多糖浸浴108h后, 羅氏沼蝦的鰓和肝臟組織中的ACP、POD、PPO等3種免疫酶活力都能明顯增強。即酵母細胞壁多糖是一種對羅氏沼蝦免疫系統有促進作用的免疫增強物質, 可以顯著增強羅氏沼蝦的免疫抗病能力。而在較高濃度H2S (0.15 mg/L)污染存在的情況下, 預先經125 mg/L的酵母細胞壁多糖浸浴處理過的羅氏沼蝦與沒有經酵母細胞壁多糖浸浴的羅氏沼蝦相比, 其鰓中ACP、POD、PPO酶活力和肝臟中ACP、PPO酶活力均顯著高于后者的。即表明在H2S污染存在的情況下, 酵母細胞壁多糖仍然能明顯提高羅氏沼蝦鰓ACP、POD、PPO酶活力和肝臟中ACP、PPO酶活力。這說明酵母細胞壁多糖能夠在一定程度上抑制H2S這種環境因子所造成的羅氏沼蝦體內免疫功能下降的破壞作用, 消除其對羅氏沼蝦機體的危害, 增強羅氏沼蝦抵御外來異物的免疫能力。這與已有研究結論相類似, 如胡俊茹等[15]報道在南美白對蝦的飼料中添加100 mg/kg Bm的免疫多糖(酵母細胞壁), 發現其肝胰腺中的ACP和POD活性都極顯著地升高, 且增強了其抗哈維弧菌感染的能力。Sung,.[16]用從酵母菌細胞壁中提取的β-1, 3-葡聚糖的懸浮液浸泡斑節對蝦(), 發現18d內蝦體內的PPO的活性明顯上升, 且對蝦抵抗創傷弧菌()的能力增強了。Chang,.[17]用含有適量β-葡聚糖的飼料來喂養草魚, 結果表明含有適量β-葡聚糖的飼料可顯著改善其超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PPO)等免疫指標的活性。Steiner,.[18]發現, 酵母葡聚糖可提高大西洋大麻哈魚巨噬細胞內溶菌酶的產量。

綜上所述, 酵母細胞壁多糖作為一種免疫激活劑, 對羅氏沼蝦免疫系統有明顯促進作用, 且對H2S這種環境因子所造成的羅氏沼蝦免疫下降有一定的抑制作用, 從而可以顯著增強羅氏沼蝦的免疫抗病能力。因此, 在沼蝦養殖生產中除了要對養殖水體的H2S濃度進行實時監控, 并采取相應的措施來減少或消除水體中的H2S, 還可考慮通過適量添加酵母細胞壁多糖等免疫激活劑來降低H2S對沼蝦的免疫破壞作用。

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Effects of yeast cell wall polysaccharides and H2S on the activities of three immune enzymes of

XU Yan, YU Jing, WANG Fang and ZHANG Dan-Feng

(College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

Yeast cell wall polysaccharide; Hydrogen sulfide;; Acid phosphatase; Peroxidase; Phenoloxidase

2012-12-18;

2013-11-17

上海師范大學科研項目(SK201112); 上海師范大學校級重點學科項目(DZL808)資助

許燕(1962—), 女, 浙江嘉興人; 副教授, 博士; 研究方向為甲殼動物學生理生化。E-mail: xuyan6@shnu.edu.cn

S945.4

A

1000-3207(2014)02-0382-04

10.7541/2014.54