高效液相色譜法測定雪膽素片中雪膽素甲的含量

蘇 健

（昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650032）

“雪膽素片”是云南省在上世紀80年代初從彝族藥物“羅鍋底”開發的成藥制劑，收載于《衛生部藥品標準》[1]，具有清熱解毒，抗菌消炎之功效，用于菌痢、腸炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等[2]。其藥效物質是從羅鍋底Hemsleya maerosperma C.Y.Wu等葫蘆科雪膽屬植物中提取的“雪膽素”，主要含有三萜類成分雪膽素甲（Cucurbitacin IIa）和雪膽素乙（Cucurbitacin IIb）[3]。

在“雪膽素片”及其原料藥“雪膽素”現行標準中，其質量控制項的定量測定部分采用的是分光光度法測定雪膽素甲的含量。隨著藥品安全要求的提高和藥品質量控制技術的發展，該方法已經不能適應目前行業發展需求。經過較為系統的研究，我們建立了一種測定雪膽素片中雪膽素甲含量的高效液相色譜方法，可用于雪膽素及其制劑的質量控制。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高液相色譜儀（美國安捷倫公司），HPLC 1100 ChemStation工作站；AEG-45SM 型百萬分之一分析天平（日本島津公司）；上海Branson B3200S超聲清洗器；依利特色譜柱（Kromasil C18填料，4.6×150mm，5μm）。對照品雪膽素甲由中國食品藥品檢定研究院提供（編號111518）。流動相用乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。雪膽素片藥品為昆明宇斯藥業有限責任公司產品。

2 方法與結果

2.1 測定條件

2.1.1 色譜條件

經過優選的色譜條件如下：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱溫25℃；流動相用乙腈-水的混合溶液（40∶60），流速1mL/min，檢測波長212nm，進樣量10μL。理論板數以雪膽素甲峰計算不低于6000。在此條件下（圖1），雪膽素甲對照品峰的拖尾因子為0.99，雪膽素片樣品中雪膽素甲和鄰近峰分離大于2.0，陰性對照樣品無干擾，符合藥品分析的一般技術要求。

圖1 雪膽素甲（a）、雪膽素片（b）、陰性對照樣品（c）的高效液相色譜

2.1.2 檢測波長確定

取雪膽素甲對照品以甲醇溶解，以甲醇作空白對照在200～400nm波長范圍掃描紫外吸收，結果在212nm波長處有最大吸收，故選擇212nm為檢測波長，結果見圖2。

圖2 雪膽素甲紫外吸收曲線

2.2 對照品溶液制備

精密稱取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的雪膽素甲對照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的溶液，臨用時用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液制備

取雪膽素片，研細，取約0.7g，精密稱定，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理10min，放冷，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，臨用時用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 線性關系的考察

按上述方法制備雪膽素甲對照品溶液，濃度為0.242mg/mL，分別精密量取對照品溶液 1μL，2μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL，按上述色譜條件進樣測定，以進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行線性回歸處理，回歸方程為Y=246.53X+9.0096，r=0.9999（n=7）。結果表明，雪膽素甲在進樣量0.242～6.05μg之間與峰面積呈良好線性關系，結果見表1。

表1 線性關系考察

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μL，按上述色譜條件，連續進樣6次，測得峰面積積分值的平均值為605.26，RSD 為 0.36%（n=6），結果見表 2。

表2 精密度實驗

2.6 穩定性試驗

取同一批號雪膽素片（20120902），依法制成供試品溶液，按上述色譜條件測定7次，每次間隔4h，測得峰面積積分值平均值為592.63，RSD為1.52%（n=7）。結果表明，樣品在24h內穩定，結果見表3。

表3 穩定性實驗

2.7 重現性試驗

取同一批號雪膽素片（20120902），平行取6份樣依法制成供試品溶液，按上述色譜條件外標法測定雪膽素甲的含量，以標示量計雪膽素甲的平均含量為104.37%，RSD為0.26%（n=6）。結果表明，該法重現性良好，結果見表4。

表4 重現性實驗

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的雪膽素片（批號：20120902，8.26mg/g）研細，取9份，每份0.35g，精密稱定，再分別加入雪膽素甲對照品適量，按供試品溶液的制備和樣品測定項下操作，平均回收率為96.80%，RSD為 0.44%（n=9），結果見表 5。

2.9 樣品測定

取雪膽素片樣品共10批，按照上述確定的方法測定，結果見表6。

3 討論

葫蘆科雪膽屬植物中富含三萜類成分，其中以雪膽素類成分為主[4]。雪膽素具有較高的藥理活性，有廣譜抗菌效果，并且對心血管系統也有作用，雪膽屬植物分布比較廣泛，其中又以云南和浙江資源較豐富[5]，以雪膽屬植物開發的制劑品種繁多[6]，因此有效控制好這類制劑的質量有重要的意義。

表5 加樣回收率試驗結果

現行雪膽素片質量標準中采用可見紫外分光光度法測定雪膽素甲的含量，此方法用比色法定量，利用化學顯色的模式測定吸光度，以發色官能團的表征來測定總量，但測定結果包含具有相同官能團結構的三萜同系物，轉專屬性差，同時受實驗操作、環境條件等因素影響較大。而高效液相色譜方法是在色譜分離的基礎上，對于特定位置的吸收峰進行定量，更具有專屬性，測定結果更客觀，并且實驗操作更簡化，受環境等條件影響更小。

現研究采用高效液相色譜外標法測定雪膽素甲的含量，在專屬性、準確度、靈敏度、重現性、穩定性等方面均能達到藥品分析的技術要求，可作為雪膽素及其制劑的定量檢測方法，更好地控制其質量。

表6 雪膽素片的含量測定結果

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.WS3-B-3694-98《衛生部藥品質量標準》中藥成方制劑第19冊[S].1998：202.

[2]陳夏靜，伍怡穎，匡文娟，等.雪膽素片抗炎鎮咳作用的實驗研究[J].四川生理科學雜志，2009，31（4）：153-154.

[3]聶瑞麟，陳宗蓮.雪膽屬植物化學研究歷史和現狀[J].云南植物研究，1986，8（1）：115-124.

[4]徐曉婷，鄧志鵬，仲浩，等.雪膽素的研究進展[J].齊魯藥事，2012，31（10）：600-601.

[5]曾慶通，黃永超.雪膽的綜合利用[J].藥事通報，1980（5）：5-7.

[6]楊群芳，王賢英.中藥雪膽及其制劑的研究進展[J].中國藥業，2003，12（9）：76-77.