高、中、低筋力小麥胚乳不同部位蛋白體積累研究

熊 飛 周 亮 余徐潤 王 忠

(揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植面積最大、貿(mào)易量最大的糧食作物，我國小麥種植面積僅次于水稻，約占糧食作物種植面積的27%［1］。小麥胚乳在發(fā)育過程中合成大量的貯藏蛋白既是早期種子萌發(fā)的重要能量來源，也是人類植物蛋白的重要來源［2－3］。胚乳蛋白質(zhì)由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成，其中前兩者為代謝蛋白，約占籽粒蛋白質(zhì)總量的20%，決定小麥的營養(yǎng)品質(zhì)，后兩者為種子貯藏蛋白，約占籽粒蛋白質(zhì)總量的80%左右，決定小麥的加工品質(zhì)［4－5］。

小麥胚乳蛋白體是積累蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，蛋白體發(fā)育的好壞直接影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)［6］。有研究表明［7－8］，小麥胚乳細(xì)胞中的蛋白體約在花后第8～9天出現(xiàn)。小麥蛋白體出現(xiàn)的時(shí)間與品種特性和氣溫有關(guān)，蛋白體隨胚乳細(xì)胞充實(shí)而增大，多個(gè)小蛋白體相互融合形成大的蛋白體。

關(guān)于小麥貯藏蛋白體的形成有2種不同的觀點(diǎn)，即通過高爾基體形成蛋白體［9－10］還是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生出蛋白體［8］。許多研究表明［11－15］，在小麥胚乳發(fā)育及養(yǎng)分輸入時(shí)，蛋白質(zhì)在粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，濃縮于高爾基體中，由高爾基體產(chǎn)生的富含蛋白質(zhì)的高爾基體小泡從高爾基體上脫落下來，在細(xì)胞質(zhì)中相互融合或被液泡胞溶成為蛋白體［6］。Parker［16］認(rèn)為當(dāng)?shù)鞍左w出現(xiàn)時(shí)高爾基體就開始分泌電子不透明小泡。Kim等［9］通過麥醇溶蛋白的定位表明，高爾基體參與了小麥蛋白體的形成，高爾基體分泌的電子濃密小泡含有麥醇溶蛋白，這些濃密小泡與大的電子透明小泡或液泡相連，有些濃密小泡在細(xì)胞質(zhì)中相互融合形成大的蛋白顆粒，然后進(jìn)入蛋白質(zhì)貯藏液泡。

前人的研究大多集中在對(duì)單個(gè)小麥品種胚乳蛋白體發(fā)生及發(fā)育的研究［6，8－10］，而且對(duì)蛋白質(zhì)積累的研究大多是基于籽粒干物質(zhì)積累和轉(zhuǎn)運(yùn)、籽粒成分和相關(guān)酶活性等指標(biāo)分析上［2，4］，而從微觀結(jié)構(gòu)對(duì)不同專用小麥胚乳不同部位的蛋白質(zhì)積累的研究較少。本研究以不同面筋強(qiáng)度的小麥為試驗(yàn)材料，對(duì)品種間及胚乳腹部和背部蛋白體積累的差異進(jìn)行了比較研究，旨在為我國小麥品種的品質(zhì)改良和加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高筋小麥徐麥30、中筋小麥揚(yáng)麥11、低筋小麥揚(yáng)麥13:國家小麥改良中心揚(yáng)州分中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2011～2012年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)場進(jìn)行，條播，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。

1.3 穎花標(biāo)記

在開花期用記號(hào)筆點(diǎn)穎和植株掛牌相結(jié)合的方法正確標(biāo)記穎花的開花時(shí)間，標(biāo)記的穎花均為穗中部小穗基部的2朵花，在盛花期同一天掛牌標(biāo)記開花時(shí)間。

1.4 樹脂切片樣品的制備

于花后8、11、14、17 d采集大小一致的穎果，取中部2 mm橫斷置于2.5%GAL(戊二醛)前固定3 h，再經(jīng)乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷置換，用低黏性的Spurr樹脂浸透與包埋。用Leica超薄切片機(jī)切取1 μm厚的半薄切片。

1.5 半薄切片與光鏡染色觀察

用1% 甲苯胺藍(lán)(TBO)染色5 min，在 Leica DMLS光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，拍攝的照片放大倍率均為200倍。

1.6 掃描電鏡樣品制備與觀察

選取成熟干燥的飽滿籽粒，用鑷子夾住兩端，使其自然斷裂，選取斷面完整且平整的材料，用雙面膠帶將樣品粘在樣品臺(tái)上(使籽粒的斷裂面大致在同一水平面上)，離子濺射鍍金后于揚(yáng)州大學(xué)測試中心環(huán)境掃描電子顯微鏡(PhilipsXL－30 ESEM)下觀察并拍照。

1.7 蛋白體的參數(shù)測量

選取有代表性的小麥穎果4個(gè)，每個(gè)穎果腹部和背部(圖1)選取了10張光學(xué)顯微鏡拍攝的照片，從光學(xué)顯微鏡拍攝的照片上選取40個(gè)胚乳細(xì)胞，采用Image－Pro Plus軟件測量穎果斷面蛋白體的面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析。

圖1 小麥穎果胚乳腹部和背部

2 結(jié)果與分析

2.1 高、中、低筋小麥腹部胚乳細(xì)胞蛋白體積累的差異

花后8 d高、中、低筋小麥腹部胚乳細(xì)胞中開始積累小蛋白體，較分散的分布在胚乳細(xì)胞中(圖2a1，圖2b1，圖2c1)，但不同品種間蛋白體面積及數(shù)目無顯著差異(圖3)。花后11 d胚乳細(xì)胞中蛋白體增多，其中高筋小麥胚乳細(xì)胞中小蛋白體互相融合形成大蛋白體，細(xì)胞內(nèi)蛋白體面積徐麥30＞揚(yáng)麥11＞揚(yáng)麥13(圖2a2，圖2b2，圖2c2)。花后14 d胚乳細(xì)胞內(nèi)小蛋白體大量增加同時(shí)其融合形成的大蛋白聚集體增多，面積徐麥30＞揚(yáng)麥11＞揚(yáng)麥13(圖2a3，圖2b3，圖2c3)。花后17 d胚乳細(xì)胞內(nèi)蛋白體積累值達(dá)到高峰，隨著胚乳淀粉粒的逐漸增多，蛋白體被擠壓到淀粉粒間隙中，蛋白體大小和數(shù)目顯著增加，但不同品種間差異不顯著(圖2a4，圖2b4，圖2c4)。

圖2 小麥穎果腹部胚乳細(xì)胞蛋白體的發(fā)育

從胚乳細(xì)胞內(nèi)蛋白體的面積變化可知(圖3)，花后8～17 d，高、中、低筋小麥腹部胚乳細(xì)胞蛋白體面積呈現(xiàn)先慢后快的積累變化，其中8、11、14 d蛋白體面積品種間差異顯著，表現(xiàn)為徐麥30＞揚(yáng)麥11＞揚(yáng)麥13，而花后17 d蛋白體面積值無顯著差異。這說明不同品種小麥蛋白體的積累量的差異主要表現(xiàn)在發(fā)育早期即灌漿高峰期，后期差異小。

圖3 小麥穎果腹部蛋白體面積的變化

2.2 高、中、低筋小麥背部蛋白體積累的差異

由圖4可知，花后8 d高、中、低筋小麥背部胚乳細(xì)胞內(nèi)蛋白體較少，呈零星分布，品種間細(xì)胞斷面內(nèi)蛋白體總面積也無顯著差異(圖4a1，圖4b1，圖4c1，圖5)。花后11 d背部胚乳細(xì)胞內(nèi)蛋白體增多，其中徐麥30、揚(yáng)麥11蛋白體積累量高于揚(yáng)麥13(圖4a2，圖4b2，圖4c2)。花后14 d蛋白體積累量顯著增加，徐麥30胚乳細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的蛋白聚集體，同時(shí)其蛋白體面積高于揚(yáng)麥11和揚(yáng)麥13，差異顯著(圖4a3，圖4b3，圖4c3)。花后17 d，蛋白體積累達(dá)到高峰，胚乳細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了許多大蛋白體和蛋白聚集體(圖4a4，圖4b4，圖4c4)，受淀粉粒積累的影響，徐麥30胚乳細(xì)胞內(nèi)蛋白體被擠壓出現(xiàn)一定程度的變形，而蛋白體大小品種間表現(xiàn)為徐麥30＞揚(yáng)麥11＞揚(yáng)麥13。

圖4 小麥穎果背部胚乳細(xì)胞蛋白體的發(fā)育

從蛋白體面積變化趨勢可知(圖5)，花后8、11、14、17 d不同品種間蛋白體積累總量徐麥30＞揚(yáng)麥11 ＞ 揚(yáng)麥13，差異主要表現(xiàn)在11、14、17 d，其中11 ～17 d為背部胚乳細(xì)胞蛋白體的快速積累期。

圖5 小麥穎果背部蛋白體面積的變化

2.3 小麥穎果腹部和背部蛋白體積累的差異

圖2和圖4顯示高、中、低筋力小麥胚乳腹部和背部蛋白體積累的差異。以中筋力揚(yáng)麥11為例，花后8 d背部胚乳細(xì)胞中蛋白體較少，而腹部胚乳細(xì)胞中已經(jīng)積累了較多的蛋白體(圖2b1，圖4b1)。花后11 d背、腹部胚乳細(xì)胞中蛋白體顯著增加，腹部胚乳細(xì)胞中出現(xiàn)了較多的蛋白聚集體，蛋白體面積腹部高于背部，差異顯著(圖2b2，圖4b2)。花后14 d腹部胚乳細(xì)胞中出現(xiàn)了較多的大蛋白體和蛋白聚集體，而背部胚乳細(xì)胞中較少(圖2b3，圖4b3)。花后17 d隨著胚乳細(xì)胞的逐漸充實(shí)，背部、腹部胚乳細(xì)胞中均出現(xiàn)了較多的大蛋白體，腹部較多，而蛋白體面積腹部顯著高于背部(圖2b4，圖4b4)。

由圖6可知，8～14 d為蛋白體的緩慢增長期，蛋白體面積腹部高于背部。14～17 d為蛋白體的快速增長期，蛋白體面積差異較大，腹部顯著高于背部。以上數(shù)據(jù)綜合表明，對(duì)于中筋小麥揚(yáng)麥11而言，穎果腹部胚乳細(xì)胞蛋白體積累量高于背部，蛋白體積累速率經(jīng)歷了從慢到快的積累過程。

圖6 揚(yáng)麥11穎果背、腹部蛋白質(zhì)面積的變化

2.4 小麥成熟籽粒蛋白體分布的差異

圖7為高、中、低筋小麥成熟籽粒斷面掃描電鏡圖。從圖7可知，成熟籽粒胚乳細(xì)胞中淀粉粒含有大小淀粉2種形態(tài)，大淀粉粒呈橢圓形或餅形，小淀粉粒呈圓球形。不同品種間以強(qiáng)筋小麥蛋白體基質(zhì)分布稍多，充實(shí)在淀粉體間隙(圖7a)，被擠壓程度較高，而低筋小麥蛋白體基質(zhì)較少，其淀粉體之間還存在較多空隙(圖7c)，中筋小麥蛋白體分布形態(tài)介于兩者之間，差異不大(圖7b)。

圖7 小麥成熟籽粒蛋白體和淀粉粒的分布

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在小麥穎果發(fā)育過程中，高筋小麥腹部和背部胚乳細(xì)胞中蛋白體面積最高，中筋小麥次之，低筋小麥最低。這從微觀結(jié)構(gòu)角度進(jìn)一步驗(yàn)證了不同面筋強(qiáng)度的小麥蛋白質(zhì)積累的差異［2］。花后8 d胚乳細(xì)胞開始積累蛋白體，但品種間無顯著差異，而到花后11、14 d時(shí)差異達(dá)到顯著，高筋小麥胚乳細(xì)胞中蛋白體面積保持快速增長的趨勢，中筋和低筋次之，而到17 d蛋白體面積值無顯著差異。小麥胚乳細(xì)胞中積累的貯藏蛋白質(zhì)主要是麥醇溶蛋白和谷蛋白［17］。醇溶蛋白基因位點(diǎn)是一個(gè)復(fù)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都編碼數(shù)個(gè)甚至十多個(gè)等位亞基，編碼醇溶蛋白的基因位于第1、6部分同源染色體短臂上的 Gli－1、Gli－2 位點(diǎn)上［18］，麥谷蛋白分為高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基(HMW－GS)和低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基(LMW－GS)，前者由位于第一同源組群染色體長臂的Glu－A1、Glu－B1和Glu－D1位點(diǎn)的基因編碼，而后者由位于短臂上的Glu－A3、Glu－B3和 Glu － D3 位點(diǎn)的基因編碼［19－20］。從分子角度上分析，我們推測不同專用小麥貯藏蛋白質(zhì)含量的差異與這些基因表達(dá)量有關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，胚乳不同部位積累蛋白體的數(shù)量和大小不同，一般認(rèn)為，亞糊粉層蛋白體積累早且數(shù)目多，而胚乳中部蛋白體分布較少［21］。本研究將胚乳不同部位劃分成背部和腹部(圖1)，發(fā)現(xiàn)胚乳細(xì)胞中蛋白體面積腹部高于背部，而且腹部胚乳細(xì)胞中含有較多的大蛋白體，推測這種差異的形成可能與不同部位胚乳細(xì)胞發(fā)育及灌漿物質(zhì)的輸入途徑差異有關(guān)。王忠等［6］認(rèn)為，來自篩管的灌漿物質(zhì)經(jīng)珠心突起卸載至灌漿“池”，而后由2條途徑進(jìn)入胚乳，一條是經(jīng)灌漿“池”邊的傳遞細(xì)胞進(jìn)入胚乳，一條通過胚乳外圍的糊粉層細(xì)胞進(jìn)入胚乳。小麥穎果腹部離“灌漿池”近，糊粉層細(xì)胞集中，所以氮基酸等灌漿物質(zhì)充足，因此合成的蛋白體多而大，而背部糊粉層離“灌漿池”遠(yuǎn)，氨基酸等灌漿物質(zhì)運(yùn)輸距離遠(yuǎn)，因此背部胚乳灌漿物質(zhì)少，蛋白體積累少，面積小。

本試驗(yàn)選用胚乳發(fā)育時(shí)期為花后8～17 d，此時(shí)期為籽粒灌漿的高峰期。由于此時(shí)期蛋白體在胚乳細(xì)胞中積累較少，受淀粉粒積累影響程度較低，從微觀結(jié)構(gòu)上容易觀察蛋白體的發(fā)育及積累過程，因此，本研究所選時(shí)期可真實(shí)反映胚乳細(xì)胞蛋白體發(fā)育及積累的動(dòng)態(tài)規(guī)律。而在穎果發(fā)育后期，由于淀粉粒的大量積累，將蛋白體擠壓在淀粉粒空隙之間，蛋白體的大小及面積都會(huì)發(fā)生變形，因此從微觀上觀察蛋白體的發(fā)育過程以及用Image－Pro Plus軟件測量蛋白體的面積已不再適宜。

4 結(jié)論

不同筋力小麥腹部和背部蛋白體發(fā)育存在明顯差異。品種間在腹部和背部蛋白體積累量表現(xiàn)為徐麥30＞揚(yáng)麥11＞揚(yáng)麥13，尤以花后11、14 d突出;同一品種胚乳腹部和背部蛋白體積累量表現(xiàn)為腹部＞背部，且差異顯著。

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