基于氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液代謝組學觀察

劉炳祥，歐 強

(1上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院，上海200070;2上海市浦東醫(yī)院)

結(jié)核性腦膜炎(簡稱結(jié)腦)病情兇險，病死率和致殘率極高，其預(yù)后與早期診斷、及時治療密切相關(guān)［1，2］。代謝組學是后基因組時代的一個重要研究領(lǐng)域，通過比較刺激前后或不同病理生理狀態(tài)下的代謝圖譜，能夠揭示疾病發(fā)生發(fā)展的代謝機制，發(fā)現(xiàn)和篩選生物標志物，并為進一步探索治療靶點提供有用信息［3～7］。2009年12月 ～2012年12月，我們采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)觀察了結(jié)腦患者腦脊液代謝組學的變化。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 診斷標準:①有典型的結(jié)腦臨床表現(xiàn)和CSF改變，臨床抗結(jié)核治療有效;②CSF涂片抗酸桿菌陽性，或結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性，或結(jié)核桿菌DNA PCR擴增陽性。選擇符合上述診斷標準的結(jié)腦患者15例(結(jié)腦組)，其中男11例、女4例，年齡(46.0±7.8)歲。另選擇需腰麻的外傷手術(shù)患者14例(對照組)，排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，其中男10例、女4例，年齡(44.1±8.5)歲。兩組年齡、性別具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 采集兩組的 CSF 1 mL，4℃下8 000 r/min離心10 min，－80℃保存?zhèn)溆谩ＨSF樣品100μL，加入300μL冷HPLC級乙腈/甲醇的混合溶液(ACN∶MeOH=1∶1;v/v);渦旋混合2 min后，于4℃下靜置10min，14 000 r/min離心15min;取上清液250μL于GC小瓶(離心管)中，減壓揮干溶劑。

1.2.2 GC-MS分析 本實驗的儀器分析平臺為Agilent7890A GC/5975C MS系統(tǒng)。衍生化步驟:加入75∶1甲氧胺吡啶溶液(15 mg/L)，渦旋lmin后密閉，70℃下放置1 h;加入75μL三甲基硅烷化試劑(MSTFA∶TMCS=100∶1，v/v)，渦旋后密閉，室溫下反應(yīng)1 h。樣品衍生化后再加入150μL正庚烷稀釋，混勻后離心，取上清液進行GC-MS分析。GCMS分析測試參數(shù)設(shè)置:進樣口溫度270℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，質(zhì)譜檢測范圍60～600 m/z，載氣 He(0.8 mL/min)，進樣量 0.2 μL，不分流進樣。全掃描形式進行質(zhì)譜檢測，譜峰檢測和重疊峰分辨分別使用MSDchem和NIST08軟件，NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫提供化合物檢索和指認。升溫程序:初始溫度70℃，保持5 min;以10℃/min的速度升至100℃，保持5 min;以10℃/min的速度升至200℃，保持5 min;以100℃/min的速度升至300℃，保持10 min。

圖1 兩組CSF經(jīng)GC-MS分析后的TIC

1.2.3 模式分析 在R軟件平臺下采用自寫的程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號，導入TagFinder軟件進行保留時間校正、峰對齊和碎片歸屬分析，所有參數(shù)均為缺省設(shè)置。在EXCEL軟件中進行后期編輯，將結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量、觀察量(樣本)和積分面積。最后將數(shù)據(jù)導入到Simca-P11.0商業(yè)軟件中進行非監(jiān)督主成分分析(PCA)［8］和有監(jiān)督的正交偏最小二乘方判別分析(O-PLS-DA)，模型驗證參數(shù)為R2Y、Q2，R2Y代表模型可解釋的變量，Q2代表模型的可預(yù)測度，R2Y、Q2高于0.5即認為該模型穩(wěn)定可靠。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)采用±s表示，選擇較優(yōu)的模式分析兩組主成分的重要性因子(VIP)值，進行t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GC-MS分析結(jié)果 兩組CSF經(jīng)GC-MS分析后，得到代表性總離子流圖(TIC)，見圖1。

2.2 PCA和O-PLS-DA分析結(jié)果 采用PCA分析共得到6 個主成分，R2Y=0.783，Q2=0.675;采用 OPLS-DA分析共得到1個主成分和1個正交成分，R2Y=0.935，Q2=0.887;O-PLS-DA 方法的 R2Y 和 Q2參數(shù)值均高于PCA，提示O-PLS-DA要優(yōu)于PCA。

2.3 兩組CSF差異代謝物分析結(jié)果 根據(jù)保留時間和片段鑒定代謝產(chǎn)物，搜索NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫定性差異性代謝物。根據(jù)GC-MS的TIC中各峰保留時間選擇共有峰，用相對峰面積(各峰與內(nèi)標峰的比值)來表示代謝物水平，以判斷變化趨勢。與對照組比較，結(jié)腦組CSF中的代謝物表達下調(diào)10個(L-蘇氨酸、來蘇糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、單棕櫚酸甘油、十八酸甘油酯)，表達上調(diào)1個(山梨醇)，見表1。

表1 兩組CSF差異代謝物分析結(jié)果

3 討論

代謝物居于基因和蛋白質(zhì)的下游，其水平變化可以說明生物體對外源刺激和病理變化的綜合應(yīng)答［9］。通過模式識別方法分析機體在不同狀態(tài)下的代謝表型和代謝動態(tài)變化，可以更好地了解病變過程及機體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和作用機制［10］。GCMS是當前最為活躍的聯(lián)用技術(shù)，具有很好的分離效率，可由計算機對MS圖譜進行化合物數(shù)據(jù)庫的自動檢索核對，有利于迅速鑒識樣品［11，12］。我們運用GC-MS技術(shù)，對結(jié)腦和正常對照者CSF樣本進行檢測，通過對檢測到的代謝物離子及其相對含量進行多元統(tǒng)計學分析，建立了基于模式識別技術(shù)的代謝輪廓聚類區(qū)分模型。

本試驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)腦患者CSF中來蘇糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖水平均有不同程度下降，提示結(jié)腦患者糖代謝發(fā)生嚴重紊亂。推測可能為結(jié)核桿菌破壞了腦膜細胞，損傷的腦膜細胞釋放出葡萄糖酵解酶，促進了糖酵解過程，使得CSF中糖含量降低。同時一些炎癥細胞的代謝產(chǎn)物抑制了血腦屏障的膜攜帶運轉(zhuǎn)功能，使血糖向腦脊液運轉(zhuǎn)發(fā)生障礙，導致腦脊液糖含量減少。臨床上關(guān)注并監(jiān)測CSF中這類物質(zhì)，可能有利于輔助診斷和評估病情。

L-蘇氨酸是一種必需的氨基酸，參與構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)，是動物免疫球蛋白分子中的主要氨基酸之一。缺乏蘇氨酸會抑制免疫球蛋白和T細胞、B細胞及其抗體的產(chǎn)生。在炎癥性疾病發(fā)生時，機體對蘇氨酸的需求增加，用于合成急性反應(yīng)蛋白。結(jié)腦患者CSF中L-蘇氨酸顯著降低，提示結(jié)腦患者氨基酸代謝紊亂。推測可能是機體炎癥反應(yīng)加劇，蘇氨酸大量參與抗氧化作用，導致消耗增加。故密切關(guān)注蘇氨酸的動態(tài)變化，對于了解病情具有非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，補充蘇氨酸能夠滿足由感染所致氨基酸需求的增加，減少肌肉蛋白的降解［13］。臨床上對蘇氨酸水平顯著下降的結(jié)腦患者應(yīng)積極給予補充，加強營養(yǎng)支持治療。

累積的山梨醇直接產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，影響蛋白激酶活性，使 Na+-K+-ATP酶轉(zhuǎn)運Na+和K+的能力減弱，細胞膜去極化受阻，細胞內(nèi)滲透壓增高，細胞腫脹、變性、壞死，從而導致神經(jīng)細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損，出現(xiàn)神經(jīng)病變［14］。結(jié)腦患者CSF中山梨醇水平升高，可能與多元醇代謝通路異常活躍有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)腦患者CSF中十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、單棕櫚酸甘油及十八酸甘油酯水平較正常人顯著降低，提示結(jié)腦患者脂肪酸代謝出現(xiàn)紊亂，其確切機制尚待進一步研究。

總之，本研究采用GC-MS對結(jié)腦患者CSF代謝輪廓進行了研究，發(fā)現(xiàn)了一些與結(jié)腦相關(guān)的特征代謝物，可以從分子水平更好地認識結(jié)腦的發(fā)生機制，為其診斷和治療靶點提供可靠的分子水平上的代謝證據(jù)。

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