慢病毒介導的ATF5基因沉默及其對荷人卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影響

蓋雪飛，谷 雪，丁朝霞，胡 明，王 斌，陳愛平，錢冬萌

(1青島大學醫學院附屬醫院，山東青島266003;2青島大學)

卵巢癌是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤，居女性生殖系統三大惡性腫瘤之首，嚴重威脅女性的健康和生命［1］。人轉錄激活因子5(ATF5)是轉錄激活因子/cAMP應答元件結合蛋白家族的新成員，不僅參與細胞的生長、分化、應激、凋亡等，還參與腫瘤的發生［2～4］。RNA 干擾(RNAi)技術可以特異、高效、快速地抑制靶基因的表達，從而廣泛用于基因治療的研究［5］。2012年11月 ～2013年9月，我們利用ATF5-siRNA慢病毒載體，觀察ATF5基因沉默對荷人卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影響，以期為卵巢癌的基因治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞株SKOV3購于上海細胞庫;SPF級BALB/C-nude雌性裸鼠30只購于北京維通利華，4～6周齡，體質量為15～18 g。ATF5-siRNA慢病毒載體購于上海吉凱基因公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購于武漢博士德生物有限公司，TUNEL試劑盒購于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組處理 取對數生長期的人卵巢癌SKOV3細胞，經胰酶消化后，1 000 r/min離心10 mim。無血清培養基重懸，計數，調整細胞懸液密度為5×107/mL，每只裸鼠皮下注射100μL。注射7 d后，隨機分為實驗組、陰性對照組和空白對照組各10只。實驗組瘤內注射ATF5-siRNA慢病毒100 μL/(只·次)，陰性對照組瘤內注射空載慢病毒100μL/(只·次)，空白對照組瘤內注射PBS 100 μL/(只·次)，隔天1次，共7次。

1.2.2 成瘤情況觀察 觀察裸鼠的一般情況，包括飲食、睡眠、活動狀態等。每隔3 d用游標卡尺測量裸鼠皮下移植瘤的最長徑及最短徑，計算移植瘤的體積，并繪制移植瘤生長曲線。移植瘤體積(V)=0.523 6×長徑×短徑2。4周后處死裸鼠，取出移植瘤組織并稱重，計算實驗組抑瘤率。實驗組抑瘤率=(空白對照組瘤重－實驗組瘤重)/空白對照組瘤重×100%。

1.2.3 移植瘤組織 ATF5 mRNA檢測 采用 RTPCR法。Trizol法提取總RNA，RNase處理后逆轉錄合成 cDNA。ATF5上游引物:5'-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3'，下 游 引 物:5'-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-3'，擴增長度:114 bp。內參基因βactin上游引物:5'-TGGAACGGTGAAGGTGACAG-3'，下游引物:5'-GGCTTTTAGGATGGCAAGGG-3'，擴增長度:154 bp。PCR反應條件:94℃預變性5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 30 個循環，72℃延伸10 min，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。UVP凝膠成像系統拍照，Quantity One軟件進行灰度分析，計算ATF5 mRNA與內參基因的比值。

1.2.4 移植瘤組織ATF5蛋白檢測 采用Western blot法。提取3組移植瘤組織總蛋白，進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶封閉，加入5%脫脂奶稀釋的兔抗人ATF5多克隆抗體，室溫孵育2 h，4℃過夜，TBST洗膜。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜。增強化學發光法(ECL)發光壓片顯色，以β-actin為參照蛋白，用Quantity One軟件進行分析。

1.2.5 移植瘤組織凋亡檢測 采用TUNEL法。將移植瘤組織制成石蠟切片，脫蠟、水合，細胞通透液處理組織8 min，加入TUNEL反應混合液50μL、convert-POD 50μL，最后加入 DAB底物50μL顯色，中性樹膠封片。400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，計數1 000個細胞中的凋亡細胞數;凋亡細胞核為棕黃色或棕褐色，其余為藍色。凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組成瘤情況比較 與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組移植瘤生長速度明顯減慢，見插頁Ⅲ圖6。實驗組瘤重(0.63±0.06)g，明顯低于陰性對照組(1.14 ±0.07)g及空白對照組(1.25 ±0.08)g，P均＜0.01;陰性對照組與空白對照組比較，P＞0.05。實驗組抑瘤率49.60%。

圖6 3組移植瘤生長曲線

2.2 3組ATF5 mRNA及蛋白表達比較 實驗組ATF5 mRNA及蛋白相對表達分別為0.40±0.09、0.46 ±0.05，陰性對照組分別為 0.67 ±0.07、0.72±0.03，空白對照組分別為 0.80 ± 0.07、0.82 ±0.05;實驗組與陰性對照組、空白對照組比較，P均＜0.01;空白對照組與陰性對照組比較，P ＞0.05。見圖 1、2。

2.3 3組移植瘤組織AI比較 實驗組、陰性對照組、空白對照組移植瘤組織AI分別為34.63% ±1.91%、6.04% ±0.19%、5.07% ±0.20%，實驗組與陰性對照組、空白對照組比較，P均＜0.01;陰性對照組與空白對照組比較，P＞0.05。

3 討論

圖1 3組ATF5 m RNA表達

圖2 3組ATF5蛋白表達

卵巢癌的病死率位居婦科惡性腫瘤首位，盡管手術技巧的提高及順鉑、紫杉醇等化療藥物的臨床應用為卵巢癌患者帶來多重生機，但其5年生存率仍然停滯不前，主要原因是70%以上的卵巢癌診斷時病變已超出卵巢，屬于晚期并對化療耐藥。隨著分子生物學及基因學等基礎醫學的發展，與卵巢癌有關的新基因不斷被發現，對這些基因的研究為卵巢癌的診斷和靶向治療提供了許多新靶點［6，7］。ATF5在多種惡性腫瘤組織中高表達，包括神經膠質瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等，而在正常組織中低表達或不表達［8］。RNAi是一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默［9］。

Angelastro等［10］通過逆轉錄病毒介導 ATF5靶向的siRNA轉染膠質瘤細胞，引起膠質瘤細胞發生顯著凋亡，而不引起正常腦細胞的凋亡。本研究結果顯示，與陰性對照組及空白對照組相比，實驗組移植瘤體積及重量均明顯減少，其抑瘤率達49.60%。該結果表明，慢病毒介導的ATF5-siRNA可以直接感染移植瘤組織并抑制其增殖。本研究中，與陰性對照組及空白對照組相比，實驗組移植瘤組織內ATF5 mRNA及蛋白相對表達均明顯減低，說明慢病毒介導的ATF5-siRNA能抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤中ATF5基因的表達;而實驗組AI則明顯升高，結合3組腫瘤生長曲線可知，ATF5能明顯抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長并促進其凋亡。以上結果均與齊亞妮等［11］的研究結果一致。

綜上所述，ATF5-siRNA慢病毒直接注射后可以成功感染移植瘤，導致ATF5 mRNA及蛋白表達的下降，從而抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長，并能誘導移植瘤組織內細胞的凋亡。因此，ATF5可能是卵巢癌基因治療的有效靶點。這為ATF5作為靶基因，應用于卵巢癌的臨床治療提供理論依據。

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［10］Angelastro JM，Canoll PD，Kuo J，et al.Selective destruction of glioblastoma cells by interference with the activity or expression of ATF5［J］.Oncogene，2006(25):907-916.

［11］齊亞妮，錢冬萌，蘆進榮，等.沉默ATF5對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，6(11):822-826.