五味消毒飲的體外抑菌實驗研究

楊宏靜，李小山，楊志波

（1.重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶 404120；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007）

五味消毒飲出自《醫宗金鑒》，以金銀花為君藥，由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子組成，具有清熱解毒、消散疔瘡等功效，臨床上廣泛用于五官、內科、外科、婦科等疾患[1-2]。當前世界范圍內抗生素的濫用及細菌的耐藥情況越來越嚴重，許多中藥方被民間用于防止感染性疾病，將中草藥中的有效成分用于臨床抗感染是一項重要課題[3]。通過中藥復方五味消毒飲的體外抑菌實驗[4]，觀察五味消毒飲對臨床常見菌群金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌的抑菌效果，為中藥復方五味消毒飲的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 五味消毒飲復方藥液制備 五味消毒飲由金銀花、野菊花、紫背天葵子、紫花地丁、蒲公英組成，分別稱取上述藥材各5g，粉碎后紗布包裹，加水100ml浸泡1小時，微火加熱煮沸30分鐘，稍加冷卻過濾藥液后將藥渣按上述方法再操作一次，合并兩次濾液，60℃濃縮至5ml。用旋轉蒸發儀蒸發濃縮至100%的提取物水煎藥液（即每毫升藥液含原生藥1g），0.1MPa，120℃條件下滅菌15分鐘，用三蒸水做二倍稀釋，裝瓶置4℃冰箱保存備用。

1.1.2 供試菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、白色念珠菌均為本實驗室存留；培養基為抑菌實驗通用培養基：瓊脂培養基和沙氏培養基。

1.1.3 儀器 垂直流超凈工作臺、旋轉蒸發儀RE-52A、DH3600A型電熱恒溫培養箱、分光光度計（鄭州杜甫儀器廠）、手提式高壓滅菌鍋、2D-85型恒溫振蕩器、隔水式培養箱（JT75-1）、TU-1800型紫外可見分光光度計、ZD-85型恒溫搖床、AB204-S基礎型電子分析天平、高壓滅菌器等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備（1）細菌菌懸液制備。將實驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌）接種于瓊脂培養基斜面上，37℃培養過夜后將活化菌轉種，37℃培養16小時，再次轉種增殖培養8小時，加入培養基校正，使其濃度約為2×107CFU/ml。（2）白色念珠菌制備。將白色念珠菌接種于沙氏培養基斜面，30℃培養48小時，將活化菌轉種培養16小時，再轉種于瓊脂培養基，增殖培養6小時，用沙氏液體培養基校正，使其濃度約為2×107CFU/ml。

1.2.2 擴散法 擴散法采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）。首先制備含有定量五味消毒飲藥液的紙片（每片含結晶紫20μl）。選用吸水力強的濾紙打孔制成直徑6m m圓片，高壓滅菌烘干并逐片定量加樣（五味消毒飲提取液）后置于37℃的溫度下，2小時烘干，然后同法用生理鹽水制作抗菌藥物紙片的陰性對照。紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍區域擴散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內，測試菌的生長被抑制形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映了測試菌對五味消毒飲的敏感程度。

1.2.3 試管二倍稀釋法 取無菌試管10支，分別加入沙氏培養基1ml，第1管為空白對照，第2管開始加入藥液1ml，混勻，連續倍比稀釋至第9管，第10管為陽性對照。10只試管再加入菌懸液100μl，使每管最終菌液濃度約為5×106CFU/ml。其中細菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌）37℃恒溫培養箱中培養16～18小時，白色念珠菌28℃恒溫培養箱中培養20～24小時。培養結束后每支試管中吸取100μl在適宜培養基上進行平皿涂布，倒置培養。

1.2.4 MIC測定 將上述試管中的培養液，每支試管中吸取1ml移種于相應瓊脂培養基上，倒置培養，以平皿上菌落數小于陽性對照為五味消毒飲對該菌種的M I C。

2 結果

2.1 涂布菌含量測定

按上述方法測定了各常見菌涂布菌液濃度。大腸埃希菌2.1×108個/ml，變形桿菌1.1×108個/ml，金黃色葡萄球菌3.7×108個 /ml，白色念珠菌 1.4×106個 /ml。

2.2 擴散法結果

按上述擴散法在恒溫培養箱中培養細菌，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及變形桿菌在37℃恒溫培養箱中培養24小時；白色念珠菌在28℃恒溫培養箱中培養24～48小時，然后進行觀察。結果顯示：五味消毒飲提取液均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌有不同程度的抑制作用，見表1。

表1 五味消毒飲提取液對4種常見菌的抑制結果（mm）

2.3 試管二倍稀釋法結果

量取連續倍比稀釋的五味消毒飲提取液與稀釋菌液恒溫培養，玻璃皿涂板測定五味消毒飲提取液對不同菌株的M I C，結果見表2。

表2 五味消毒飲提取液對不同菌株的最小抑菌濃度

3 討論

實驗結果表明，五味消毒飲對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌作用，抑菌程度與M I C具有相關性，與實驗方法中藥物濃縮過程中的損耗與菌懸液最終濃度有關，更具體的原因有待進一步研究。本實驗中試管二倍稀釋法測定中草藥提取液的M I C參考了相關文獻報道。培養基為細菌的生長繁殖提供了營養成分和合適的環境，可能會影響中藥體外抑菌效果。細菌在不同的培養基上生長性能差別較大，培養基的選擇和正確使用非常重要。中藥抗菌因子對細菌的抑制效果受生長環境的影響較大，培養基越適合，細菌生長越好，抑菌作用就越弱。培養基對抑菌作用的影響也反映了中藥體內和體外抑菌效果的差異，通過體外實驗獲得的抗菌譜必須在臨床上進一步驗證確定。

五味消毒飲雖然在體外可抑制常見菌，但這并不意味著中藥方劑功效大于單味藥，而且中藥復方制劑的作用原理在于“君臣佐使”對機體的調理，只有通過體內實驗，才能體現中藥方劑的功效，所以在中藥抑菌實驗中要注重復方的研究，也應該注重中藥在體內的研究。

[1]朱益超.五味消毒飲治療淋病性尿道炎50例[J].實用中醫藥雜志，2003，19（6）：286-287.

[2]李波.經效散合五味消毒飲加減治療外傷性真菌感染所致角膜潰瘍38例臨床研究[J].中國中醫眼科雜志，2009，19（5）：286-288.

[3]舒鴻飛.五味消毒飲在皮膚科的臨床運用[J].湖北中醫雜志，2001，23（12）：224-225.

[4]錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗教程[M].北京：北京大學出版社，2005.