紫菜藻膽蛋白的制備及其體外模擬消化研究

姚興存， 舒留泉， 賈維寶， 劉 雪

（淮海工學院 海洋學院，江蘇 連云港 222005）

藻膽蛋白是紫菜等某些藻類特有的重要捕光色蛋白，分為藻紅蛋白（PE）、藻藍蛋白（PC）、藻紅藍蛋白（PEC）和別藻藍蛋白（APC）4大類，有的藻類中蛋白質的含量可以高達細胞干重的25%~28%[1-2]。藻膽蛋白在食品、化妝品、醫藥、生物工程等領域有廣泛的應用與開發利用價值。

條斑紫菜是江蘇沿海主要的養殖海藻，目前其主要的利用途徑是制成紫菜干品供直接食用。紫菜不僅具有獨特的風味和營養價值，而且在《本草綱目》中記載了其獨特的藥用價值，現代科學研究還表明紫菜具有降血脂、抗凝血、抗腫瘤、抗輻射等生理活性[3-5]。多年來，對紫菜蛋白質的研究主要集中在藻膽蛋白的提取、純化與生物活性[6-7]，以及蛋白質的酶解技術與酶解物的生物活性等方面[8-9]，對紫菜藻膽蛋白在人體中模擬消化情況尚未見研究報道。干紫菜中含有30%~40%的蛋白質，作為食品食用時人體的消化利用情況是決定其營養價值的主要條件。目前，研究食物消化主要有體外法和體內法，體內法復雜、時間長、費用高，體外模擬消化法是根據人體胃腸消化液的主要成分與消化環境，在體外建立模擬胃腸消化體系，利用精制的消化酶在試管內進行的消化實驗，可近似反映人體胃腸對食物的消化狀況[10-11]。

作者首先確定紫菜中藻膽蛋白的制備方法，再采用人工胃液、人工腸液進行體外消化試驗，根據游離氨基酸的生成量、消化產物的生物活性和SDS-PAGE圖譜考察紫菜藻膽蛋白的消化情況，以期初步明確紫菜藻膽蛋白的模擬消化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜：購于本地紫菜加工企業，實驗室中將其50℃烘干至質量恒定，高速粉碎機粉碎，100目過篩后超臨界CO2流體萃取脫除脂肪，儲于廣口瓶中干燥保存。

胰蛋白酶（酶活 2.5×105U/g）、胃蛋白酶（酶活力 3×106U/g）： 美國 BBI試劑公司產品； 蛋白Marker：TaKaRa生物工程公司產品；二苯代苦味酰基（DPPH）：美國 Sigma公司產品；三氯乙酸（TCA）、鄰苯二甲醛（OPA）、考馬斯亮藍、賴氨酸：均為國產分析純。

1.2 儀器

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產品；Primo R多用途臺式高速冷凍離心機：美國熱電公司產品；全自動酶標儀：美國Bio-Tek公司產品；E200生物顯微鏡：日本Nikon公司產品；JSM-639OLA電子掃描顯微鏡：日本電子株式會社產品；DYY-241電泳儀：北京六一電泳儀廠產品；KS-300超聲波細胞粉碎機：寧波科生儀器廠產品。

1.3 方法

1.3.1 紫菜藻膽蛋白制備 準確稱取一定量干紫菜于燒杯中，以1 g∶50 mL的比例加入蒸餾水，充分混勻后，使用適當方法進行處理，使紫菜細胞受到一定程度的破壞，從而釋放其中蛋白質。以4 000 r/min離心20 min，取上層清液，將殘渣加少量水重復溶解后重復離心1次，合并上清液并定容。將紫菜藻膽蛋白溶液加入（NH3）2SO4粉末，使其飽和度達到60%，混勻后靜置鹽析30 min，8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，加入適量磷酸緩沖液溶解沉淀蛋白，定容后保存于冰箱中備用。

1.3.2 紫菜藻膽蛋白提取率計算 藻膽蛋白提取率以提取液中蛋白質質量占樣品原料總質量來表示，按下式計算：

式中：m1為提取液中蛋白質質量（mg）；m0為樣品原料質量（mg）。

1.3.3 顯微鏡觀察與電鏡掃描 光學顯微鏡觀察：將蛋白質提取并離心后的殘渣加入20倍的蒸餾水，混勻后取少量制作成玻片，置于顯微鏡下觀察，放大倍數為10×100，拍照。

電子掃描顯微鏡觀察：將處理后的紫菜葉片切取約0.5 cm×0.5 cm，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗 3次，體積分數50%、70%、80%、90%、95%梯度丙酮各1次，各15 min，100%丙酮加無水硫酸鈉2次，體積分數各 10 min，丙酮與乙酸異戊酯 2∶1、1∶1、1∶2 混合液脫水處理，各10 min，純乙酸異戊酯一次30 min[12]。在離子濺射儀上噴金后，將樣品置于掃描電鏡下1000×掃描觀察并拍照。

1.3.4 紫菜藻膽蛋白的體外消化過程 人工胃液配制[13]：準確稱取 0.4 g NaCl，0.64 g 胃蛋白酶，吸取1.4 mL的濃鹽酸，待充分溶解后定容至100 mL。人工腸液配制[13]：準確稱取1.36 g的KH2PO4加入25 mL雙蒸水，待充分溶解后加入19 mL 0.2 mol/L NaOH和40 mL的雙蒸水，混勻后加入2 g胰蛋白酶，充分溶解后用1 mol/L的NaOH調節 pH至 7.5±0.1，最后用雙蒸水定容至100 mL。

體外消化過程模擬：吸取10 mL人工胃液或人工腸液裝入三角瓶中，放置37℃恒溫水浴鍋中預熱10 min。將待消化的藻膽蛋白溶液10 mL加入錐形瓶，開始計時，按照設定的時間梯度取出一定量的消化液，立即終止反應。胃液水解反應的終止用0.168 mol/L的NaCO3調節pH至7~8，腸液水解反應的終止則在95℃下加熱5 min。

1.3.5 藻膽蛋白質質量分數測定 水溶液中藻膽蛋白質質量分數測定采用Lowry法，牛血清白蛋白作標準品[14]。

1.3.6 游離氨基酸質量濃度測定 將不同的消化液加入等體積的體積分數10%TCA，4 000 r/min離心20 min，調節pH至中性，采用鄰苯二甲醛法測定游離氨基酸質量濃度[15]，賴氨酸作標準品，以賴氨酸質量（0~80 μg）為橫坐標（x），A340nm為縱坐標（y），得到標準曲線方程程為 y＝0.012 4x-0.043 5，R2＝0.984 2。

1.3.7 消化產物的抗氧化作用 消化產物的抗氧化活性用消化產物對二苯代苦味酰基（DPPH）自由基清除率表示，DPPH清除率的測定采用體外試驗法[16-17]。

1.3.8 消化產物SDS-PAGE分析 將10 μL紫菜藻膽蛋白消化液與10 μL樣品溶解液混合后，與蛋白Marker同時置入沸水浴中加熱5 min，冷卻到室溫，12 000 r/min離心5 min，取上清液點樣。凝膠電泳采用12 g/dL的分離膠，10 g/dL的濃縮膠不連續體系。電泳時，電壓恒定100 V，電泳3.5 h，考馬斯亮藍R250染色液染色3 h，脫色后掃描成像。

1.3.9 數據統計與分析 采用SPSS13.0軟件對數據進行統計分析，所有數據均用平均值±標準差表示，n=3。

2 結果與分析

2.1 制備方法對藻膽蛋白提取率的影響

表1為不同提取方法的藻膽蛋白提取率。

表1 不同提取方法的藻膽蛋白提取率Table 1 Extraction rate of phycobiliprotein by different methods

表1可見，磷酸鹽緩沖液反復凍融法、水溶脹法和超聲波法的蛋白提取率相對較高。考慮到水溶脹法需5 d，應用于實際生產則提取時間太長，所以并不是理想的提取方法。超聲法法和磷酸鹽緩沖液反復凍融法都有較高的提取率，且縮短了時間。綜合考慮各因素，使用磷酸鹽緩沖液作為提取劑結合超聲波處理法應為最佳選擇。驗證試驗結果表明，當磷酸鹽緩沖液的濃度0.06 mol/L、超時功率400 W、空化比 3×10%、處理時間 20 min、溶液溫度 40℃、料液比為1 g∶50 mL時，紫菜藻膽蛋白提取率為（7.05±0.671）%，顯著高于任一方法單獨使用的提取效果。藻膽蛋白提取方法的研究始終是多年以來的研究熱點，除了上述方法之外，還有高壓勻漿法、組織搗碎法、球磨機研磨法、液氮凍融法、溶菌酶等[7]被眾多學者研究比較以便篩選高效合理的方法，但是不同的研究者由于研究角度的不同往往會得出不同的結論。因此，如何克服傳統藻膽蛋白制備技術缺陷、減少操作步驟、縮短制備時間、提高產品提取率，并能夠實現規模化工業生產，仍將是今后研究的熱點與難點。

2.2 超聲波處理的紫菜細胞顯微特征

經過超聲波處理前后的紫菜生物體細胞在10×100的光學顯微鏡下的顯微圖片見圖1，1000倍電子掃描顯微鏡的圖片見圖2。

圖1 超聲波處理前（a）后（b）的光學顯微圖Fig.1 Optical micrograph before（a）and after ultrasonic treatment（b）

圖2 超聲波處理前（a）后（b）的掃描電鏡圖Fig.2 Micrograph before （a）and afterultrasonic treatment（b）by scanning electron microscope

由圖1（a）可以看出，未經過任何處理的紫菜細胞形態完整，呈圓形或者橢圓形，且細胞排列整齊；而圖1（b）用超聲波處理的紫菜細胞，其破碎情況比較明顯，細胞變小且形狀各異，大多失去了原有的形狀而帶有一定的棱角；此外，細胞之間間距增大，說明有細胞液流出而占據細胞間空間，細胞結構受到了一定程度的破壞。圖2（a）的掃描電鏡照片可以看出，在1 000放大倍數時，未經過任何處理的紫菜葉狀體，其表面紋理排列整齊且較為平整，結構致密；經過超聲波處理的圖2（b）圖片顯示，其細胞表面上有明顯的裂口，可以說明是由于超聲空化作用而造成了細胞結構的爆裂，從而促使胞內物質溶出提高了提取率，說明超聲輔助磷酸鹽緩沖液提取具有顯著的提取優勢。

2.3 藻膽蛋白人工胃液消化過程中游離氨基酸和生物活性變化

由圖3可見，隨人工胃液消化時間延長游離氨基酸含量增加，特別是在0~20 min，消化產物中氨基酸含量的增加十分明顯，30 min以后則變化趨緩，這說明在模擬胃液消化中蛋白質在進入胃中即與胃液混合后隨之即開始了消化，20 min之前蛋白質開始大量被消化，產生了較多的游離氨基酸，30 min后氨基酸的幅度變化不大，可以說明紫菜藻膽蛋白在動物體內的消化主要在20 min之前，紫菜蛋白質是易被人類消化的優質蛋白質。此外，消化過程中，消化產物對DPPH自由基的清除率顯示了與氨基酸含量幾乎一致的變化規律，由于氨基酸的抗氧化活性要強于未水解的蛋白質，由此可知，紫菜蛋白質的快速被消化對于人體及時吸收有效營養成分并改善生命體機能具有重要意義。

圖3 人工胃液消化過程中游離氨基酸與DPPH清除率的變化Fig.3 Changes of free amino acid and DPPH removal rate by the digestion of artificial gastric juice

2.4 人工胃腸液連續消化進程分析

如圖4所示，游離氨基酸在胃液和腸液2個消化階段總體呈逐漸上升趨勢，在消化的初始階段較迅速，隨著消化時間的延長，增加量逐漸放緩。胃液消化階段，氨基酸的質量濃度從初始的8.70 mg/dL增加到30 min時的14.5 mg/dL，增加了66.7%，腸液消化階段，氨基酸質量濃度從120 min時的15.8 mg/dL增加到300 min時的20.8 mg/dL，氨基酸質量濃度有31.6%的增加。可見，紫菜藻膽蛋白的消化主要存在于胃液消化階段，由于在經過胃液消化后暴露了更多的胰蛋白酶作用位點，才使得蛋白質再度被腸液消化，游離的氨基酸得以更多產生，因此紫菜藻膽蛋白的腸液消化可以認為是胃液消化的補充與輔助。

圖4 紫菜藻膽蛋白胃腸液連續消化對氨基酸質量濃度的影響Fig.4 Amino acid variations of laver phycobiliprotein by the continuous digestion of gastrointestinal fluid

圖5 紫菜藻膽蛋白胃腸消化液的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of laver phycobiliprotein by the digestion of gastrointestinal fluid

由圖5的消化產物電泳圖可看出，紫菜藻膽蛋白在消化開始即被水解成相對分子質量低于10 000的多肽，消化產物未能在SDS-PAGE圖譜上顯現出清晰的電泳條帶，僅在10、30、60、90 min的消化液中電泳圖譜上的低相對分子質量部分 （約12 000~22 000）可見模糊的電泳影像且逐漸變淡，電泳圖與游離氨基酸分析結果能夠很好地相互印證。紫菜藻膽蛋白屬于低相對分子質量的蛋白，相對分子質量為79 000和330 000，亞基相對分子質量為19 000、20 000[18]。胃蛋白酶是內肽酶，對芳香族氨基酸具有特異性，其酶解產物為蛋白胨及少量的多肽和氨基酸，人工胃液能夠在很短時間內將絕大部分紫菜藻膽蛋白降解為多肽、氨基酸等小分子物質。

3 結語

通過研究比較幾種藻膽蛋白的提取方法，將超聲波破碎與磷酸鹽緩沖液浸泡提取結合作為藻膽蛋白的制備最佳方法，當磷酸鹽緩沖液的濃度0.06 mol/L、超時功率400 W、空化比3×10%、處理時間20 min、溶液溫度40℃、料液質量體積比為1 g∶50 mL時，藻膽蛋白的提取率最大。光學顯微鏡和掃描電鏡觀察皆發現紫菜細胞結構和形態的變化，顯示出細胞結構受到一定程度的破壞而使藻膽蛋白的提取率提高。

建立了紫菜藻膽蛋白模擬人體胃腸消化環境的消化模型，以游離氨基酸含量和DPPH自由基清除率作為評價指標并結合SDS-PAGA電泳技術考察藻膽蛋白的消化情況。結果表明，紫菜藻膽蛋白的消化主要在胃液開始消化的30 min和腸液消化開始階段，在這一時間里產生了大量的氨基酸，但隨后氨基酸的產生量逐漸放緩，水解產物的抗氧化活性同樣呈現了與氨基酸相同的變化規律。紫菜蛋白質是較易被人體消化的優質蛋白質。

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