油菜蜂花粉中核苷類成分的分離及鑒定

段元鋒， 吳盼盼， 徐德平

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

油菜（Brassica campestris L.）是十字花科蕓薹屬植物，原產中國，顏色深綠，幫如白菜，為中國大面積種植的農業經濟作物。油菜蜂花粉 （Rape Bee Pollen）是蜜蜂采集油菜的花粉，再經蜜蜂加工而成的花粉團狀物，蜜蜂在采集花粉的過程中加入了一些分泌物[1-4]。蜂花粉內含有許多的生物活性物質如酚類、類黃酮、脂類、蛋白質、維生素、微量元素等，被人們認為是天然的健康食品，因此有“濃縮的營養庫”之稱，具有抗氧化和清除自由基、抗衰老、提高免疫力等功效[5-7]。

油菜蜂花粉中功能性成分的研究已有大量文獻報道，但油菜蜂花粉中的核苷類物質研究少見報道。核苷類成分是生物細胞維持生命的重要物質，具有免疫調節、改善腦細胞代謝以及調節中樞神經等多種生理活性，人們現已研究開發了多種核苷類產品[8-10]。黃蘭等人對油菜蜂花粉中一種化合物，通過TLC薄層色譜法、LC-Q-TOF測定與腺嘌呤標品比對等輔助方法，確定化合物為腺嘌呤，并未直接分離并進行結構解析[11]。作者首次從油菜蜂花粉中直接分離出3種核苷類成分并對其化學結構進行鑒定，為油菜蜂花粉中核苷類物質的活性及生理作用等各方面的研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉：購自青海門源蜂場；ODS柱填料：Nacalai Tosoh Inc產品；AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學化學工廠產品；GF254硅膠板：山東煙臺芝罘化工廠產品；無水乙醇、甲醇、正丁醇、冰醋酸、硫酸、茴香醛、氯仿：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 儀器與設備

WFJ8-20中藥粉碎機：江陰市靈杏藥化設備有限公司產品；CQ-005萃取罐：常州市特威電氣自動化系統有限公司產品；R-1002旋轉蒸發器：上海申順生物科技有限公司產品；BS-100A自動部份收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司產品；ZF-90暗箱式紫外透射儀：上海顧村電光儀器廠產品；Avance-500核磁共振儀 ：瑞士Bruker公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 油菜蜂花粉水溶性成分的提取 稱取油菜蜂花粉10 kg，粉碎后過40目篩，置于100 L萃取罐中，按1 g∶5 mL料液質量體積比加入去離子水，60℃條件下攪拌提取3 h，過濾取濾液，渣在同樣條件下，重復提取一次，合并濾液，減壓濃縮成浸膏保存。

1.3.2 油菜蜂花粉水溶性成分的粗分離 取浸膏加適量去離子水超聲條件下溶解，上大孔樹脂AB-8 柱（10 cm×150 cm），流量 20 mL/min，依次用去離子水，體積分數20%、95%乙醇溶液進行洗脫，洗出液500 mL/段，分步收集，合并體積分數20%乙醇洗脫溶液，減壓濃縮至無乙醇，得體積分數20%乙醇洗脫物。

1.3.3 乙醇洗脫物分離 將體積分數20%乙醇洗脫物上MCI-GEL柱（5 cm×150 cm），分別用去離子水，體積分數5%、15%、25%乙醇溶液進行洗脫，自動收集器15mL/管收集洗脫液，采用TLC薄層法檢測，根據Rf值將洗脫液粗分為A，B，C等3部分，各部分分別減壓濃縮保存。

1.3.4 純化 將3部分分別上ODS-B（3 cm×100 cm）色譜柱，用乙醇溶劑梯度洗脫，流量10 mL/min，自動收集器15mL/管收集洗脫液，TLC薄層法跟蹤檢測洗脫液，將Rf值和顯色反應一致的洗脫液合并減壓濃縮，反復上 ODS-B（3 cm×100 cm）色譜柱，直至得 3個純化合物，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

1.3.5 純度鑒定 將色譜分離的純的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，通過薄層層析法（TLC）進行純度鑒定。展開劑為正丁醇-水-冰醋酸（體積比 5∶4∶3）溶液，顯色劑為甲醇-冰醋酸-濃硫酸-茴香醛（體積比 17∶2∶1∶0.1）溶液。

1.3.6 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個化合物結構鑒定 對得到的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以氘代吡啶為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為 內 標物 ， 通 過1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR進行分析。經1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR等方法鑒定其化學結構。

2 結果與討論

2.1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的純度

如圖1顯示，由TLC薄層檢測化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在薄層板上均為單一斑點，表明分離后得到的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的純度已達到核磁分析的要求。

圖1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatographic spectrum of componentⅠ、Ⅱ、Ⅲ

2.2NMR分析

2.2.1 化合物Ⅰ 白色無定形粉末，可溶解于水、含水甲醇、乙醇中。從化合物Ⅰ的1H-NMR圖譜可見，δ10.65，7.94各有1個單峰H信號，這二個H應為活潑H，6.46有1個單峰H2信號，表明這二個H是N上H，δ5.70有1個雙峰質子信號，J值為6.0，可能為糖的端基H信號，其余H信號為糖上H信號，推測該化合物含有1個糖基。13C-NMR（125 MHz）中可見到 10 個碳信號（見表 1），δ 95~110 處未見到糖的端基碳信號，δ 61~87有5個碳信號，推測該化合物含有1個五碳糖，δ 86.4應為與N相連的端基碳，經與文獻相比較得出為核糖。δ 110~160處見到5個碳信號，135DEPT中可見只有1個CH信號，其余4個為季碳，參照文獻可得這5個碳信號與鳥嘌呤一致。通過以上分析和文獻比較，確定化合物Ⅰ為鳥嘌呤核苷。

2.2.2 化合物Ⅱ 白色無定形粉末，可溶解于水，含水甲醇、乙醇中。從化合物Ⅱ的1H-NMR圖譜可見，δ8.37，8.16各有1個單峰H信號，這二個H應為活潑H，7.35有1個單峰H2信號，提示這二個H是N上H，δ5.90有1個雙峰質子信號，J值為6.0，可能為糖的端基H信號，其余H信號為糖上H信號，推測該化合物含有1個糖基。13C-NMR（125 MHz）中可見到 10 個碳信號（見表 1），δ 95~110 處未見到糖的端基碳信號，δ 61~87有5個碳信號，推測該化合物含有1個五碳糖，δ 86.4應為與N相連的端基碳，經與文獻相比較得出為核糖。δ 110~160處見到5個碳信號，135DEPT中可見只有2個CH信號，其余4個為季碳，參照文獻可得這5個碳信號與腺嘌呤一致。通過以上分析和文獻比較，確定化合物Ⅱ為腺嘌呤核苷。

2.2.3 化合物Ⅲ 白色無定形粉末，可溶解于水，含水甲醇和乙醇中。從化合物Ⅲ的1H-NMR圖譜可見，δ 13.22有1個單峰H信號，應為活潑H；δ 5.11有1個雙峰質子信號，J值為6.4，可能為糖的端基H信號，δ 1.95有一個單峰甲基，δ 5.11其余H信號為糖上H信號，推測該化合物含有1個糖基。13CNMR（125 MHz）（見表 1）中可見到 10 個碳信號，δ 95~110處未見到糖的端基碳信號，δ 89.0應為與N相連的端基碳，δ 61~87有4個碳信號，δ 41.5有一個CH2信號，推測該化合物含有1個脫氧五碳糖，經與文獻相比較得出為2-脫氧核糖。δ 110~160處見到4個碳信號，135DEPT中可見只有1個CH信號，其余3個為季碳，δ 12.9有一個甲基碳信號，參照文獻可得這5個碳信號與胞腺嘧啶一致。通過以上分析和文獻比較，確定化合物Ⅲ為胞腺嘧啶脫氧核苷。

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在13C-NMR中的碳信號Table 1 Signals of carbon in the13C-NMR of CompoundⅠ，Ⅱ andⅢ

3 結語

油菜蜂花粉的水提物，經過AB-8柱粗分離，再經MCI-GEL柱，ODS-B色譜柱分離純化，得到3種化合物，最后通過核磁共振分析，3種化合物分別為：鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胞腺嘧啶脫氧核苷。3種化合物均為首次從油菜蜂花粉中直接分離純化并進行結構分析的核苷類物質，其中的鳥嘌呤核苷、胞腺嘧啶脫氧核苷在油菜蜂花粉中首次報道。

[1]XU Xiang，SUN Liping，DONG Jie，et al.Breaking the cells of rape bee pollen and consecutive consecutive extraction of functional oil with supercritical carbon dioxide[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10：42-46.

[2]楊潔，陳純，邢建軍.油菜蜂花粉中黃酮類化合物的提取與鑒定[J].食品科學，2010，31（22）：273-278.YANG Jie，CHEN Chun，XING Jianjun.Extraction and identification of flavonoids in rape bee pollen[J].Food Science，2010，31（22）：273-278.（in Chinese）

[3]XU Xiang，GAO Yanxiang，SUN Liping.Free and esterified triterpene alcohol composition of bee pollen from different botanical origins[J].Food Research International，2012，48：650-656.

[4]馮慧，焦士蓉，唐遠謀，等.油菜花粉研究進展[J].食品工業，2011（9）：108-110.FENG Hui，JIAO Shirong，TANG Yuanmou，et al.Advance studying of rape pollen[J].Food Industry，2011 （9）：108-110.（in Chinese）

[5]XUE Xiaofeng，ZHAO Jing，CHEN Lanzhen，et al.Analysis of coenzyme Q10 in bee pollen using online cleanup by accelerated solvent extraction and high performance liquid chromatography[J].Food Chemistry，2012，133：573-578.

[6]孫毅，楊義芳，楊必成，等.油菜蜂花粉生理活性及作用機制研究進展[J].中國蜂業，2010，61（9）：5-9.SUN Yi，YANG Yifang，YANG Bicheng，et al.Advances in studies on physiological activities and mechanisms of Bee Pollen of Brassica campestris[J].Apiculture of China，2010，61（9）：5-9.（in Chinese）

[7]王霓，趙建怡，李曉華，等.蜂花粉的營養價值研究[J].廣東微量元素科學，2011，18（8）：52-54.WANG Ni，ZHAO Jianyi，LI Xiaohua，et al.The study of the nutritional value of bee pollen[J].Trace Elements Science of Guang Dong，2011，18（8）：52-54.（in Chinese）

[8]孔德平，錢大瑋，郭盛，等.9種果實種子類補益中藥的核苷類成分分析[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（4）：98-101.KONG Deping，QIAN Dawei，GUO Sheng，et al.Determination of nucleosides compounds in nine tonic traditional Chinese medicines of fruit and seeds[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2011，17（4）：98-101.（in Chinese）

[9]張雪梅，楊豐慶，夏之寧.食品中核苷類成分的藥理作用研究進展[J].食品科學，2012，33（9）：277-282.ZHANG Xuemei，YANG Fengqing，XIA Zhining.Recent advances in research on pharmaceutical functions of nucleosides and nucleotides in dietary foods[J].Food Science，2012，33（9）：277-282.（in Chinese）

[10]呂愛娟，吳皓.中藥中核苷類成分的研究進展[J].中國中醫藥信息雜志，2006，13（7）：94-97.LV Aijuan，WU Hao.Advances in research on nucleoside ingredient in traditional Chinese medicine[J].Chinese Journal of Information on TCM，2006，13（7）：94-97.（in Chinese）

[11]黃蘭，孫麗萍，薛曉鋒，等.油菜蜂花粉中一種核苷類成分的分離[J].食品科學，2011，32（17）：151-154.HUANG Lan，SUN Liping，XUE Xiao，et al.Separation of a nucleoside analogue from rape bee pollen[J].Food Science，2011，32（17）：151-154.（in Chinese）