RP-HPLC法同時測定4種唇形科植物中3個苯乙醇苷的含量Δ

李茂星，尉麗力，陶銳，2，張超，邱建國，張泉龍（.蘭州軍區蘭州總醫院全軍高原特殊環境損傷防治重點實驗室，蘭州 730050；2.蘭州大學藥學院，蘭州 730000）

獨一味[Lamioplomis rotata（Benth.）Kudo]為唇形科獨一味屬植物，以全草或根及根莖入藥，具有活血止痛、化瘀止血之功效，用于治療各種外科手術后的刀口疼痛、出血、外傷骨折等[1-2]。糙蘇（Phlomis umbrosa）、螃蟹甲（P.younghusbandii Mukerjee）和蘿卜秦艽（P.medicinalis Diels）為唇形科糙蘇屬植物，該屬植物具有抗炎、免疫抑制、抗自由基突變及抗菌等生理活性，民間用于滋補強壯、跌打損傷、消腫祛痛等。化學成分研究表明，獨一味、糙蘇、螃蟹甲和蘿卜秦艽這4種植物中都含有苯乙醇苷類成分[3-6]，該類成分具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、增強記憶、保肝和強心等作用[7-9]，可能為這幾種藥用植物的有效成分。本試驗以3個苯乙醇苷成分——acteoside、alyssonoside、isoacteoside作為含量測定指標，使用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時測定了獨一味、糙蘇、螃蟹甲和蘿卜秦艽中3個苯乙醇苷的含量，希望可以為這幾種藥用植物的進一步開發和利用提供一些理論依據。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括600型二元梯度泵、996型二極管陣列紫外檢測器（美國Waters公司）；BP210 S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；SK7200 H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

acteoside、alyssonoside、isoacteoside對照品均為本試驗室從螃蟹甲藥材中分離得到，均經光譜學和波譜學鑒定其結構（見圖1），經HPLC面積歸一化法計算其純度均在98%以上；乙腈為色譜純，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純。

圖1 3個苯乙醇苷類化合物的結構Fig 1 The structure of 3kinds of phenylethanoid glycosides

1.3 藥材

獨一味和糙蘇藥材于2010年7月分別采集于甘肅瑪曲縣和天水市，螃蟹甲和蘿卜秦艽藥材分別購于西藏林芝地區和青海果洛州，經蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定均為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Symmetry C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相:乙腈（A）-水（用醋酸調pH為4.5），梯度洗脫（0～5min，14%A；＞5～10min，14%→20%A；＞10～25min，20%A）；流速:1.0ml/min；檢測波長:330nm；柱溫:20Ⅱ；進樣量:10μl。在此色譜條件下，3個苯乙醇苷的峰形較好，與其他組分色譜峰可達基線分離。色譜見圖2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 準確稱取干燥至恒質量的acteoside、alyssonoside、isoacteoside對照品各25mg，分別置25ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品貯備液，用鋁箔作避光保護，4Ⅱ冰箱里貯藏。檢測前將各對照品貯備液配制成不同質量濃度的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取4種藥材各適量，粉碎（過四號篩），分別準確稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，稱定質量，超聲處理（功率:350W，頻率:59kHz）30min，冷卻，再稱定質量，加70%甲醇補足減失的質量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

圖2 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.獨一味地上部分；C.獨一味地下部分；D.糙蘇地上部分；E.糙蘇地下部分；F.螃蟹甲地下部分；G.蘿卜秦艽地下部分；1.acteoside；2.alyssonoside；3.isoacteosideFig 2 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.aerial parts of L.rotata；C.inferior parts of L.rotata；D.aerial parts of P.umbrosa；E.inferior parts of P.umbrosa；F.inferior parts of P.younghusbandii；G.inferior parts of P.medicinalis；1.acteoside；2.alyssonoside；3.isoacteoside

2.3 標準曲線的制備

取“2.2.1”項下各質量濃度的混合對照品溶液適量，按上述色譜條件進樣分析。以質量濃度（x）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到3個苯乙醇苷成分的線性回歸方程、線性范圍和相關系數（r），詳見表1。當信噪比為3時，得到各成分的檢出限，詳見表1。

表1 線性回歸方程及檢出限Tab 1 Linear regression equation and detection limits

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液適量，按上述色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，acteoside、alyssonoside、isoacteoside的RSD分別為1.75%、3.44%、2.45%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

取螃蟹甲藥材粉末適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品含量。結果顯示，acteoside、alyssonoside、isoacteoside的平均含量分別為3.20、1.12、1.42mg/g，RSD分別為1.49%、3.16%、4.52%（n均為6），表明本方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液適量，分別于0、1、2、4、8、12、24h按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，acteoside、alyssonoside、isoacteoside的 RSD 分別為 1.83%、2.86%、2.90%（n均為7），表明供試品溶液在24h內穩定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取適量已知含量的螃蟹甲藥材粉末，共6份，分別精密加入一定量的acteoside、alyssonoside、isoacteoside對照品，使藥材中的acteoside、alyssonoside、isoacteoside分別與加入各自對照品的質量比約為1∶1，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取獨一味、糙蘇、螃蟹甲、蘿卜秦艽藥材（地上/地下部分）粉末各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積計算藥材中acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量，結果見表3。

3 討論

3.1 流動相的選擇

上述3個苯乙醇苷結構相似、極性較大，因此流動相的極性對其分離的影響很大。本試驗考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水系統作為流動相的效果，發現采用乙腈-水梯度洗脫、用醋酸調pH為4.5時，分離度較好。

3.2 檢測波長的選擇

將上述3個苯乙醇苷分別作紫外光譜掃描，發現它們在330nm波長處均有最大吸收，故選擇330nm作為檢測波長。

表3 樣品中3個苯乙醇苷的含量測定結果（n＝3）Tab 3 Content determination of 3 phenylethanoid glycosides in samples（n＝3）

3.3 小結

本試驗結果表明，獨一味、糙蘇、螃蟹甲、蘿卜秦艽4種藥材中3個苯乙醇苷的含量各不相同，即使同一藥材不同部位中3個成分的含量也各異。獨一味地上部分中acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量比其他藥材均高；蘿卜秦艽地下部分中acteoside、isoacteoside的含量相較于其他藥材均低；糙蘇地上部分中alyssonoside的含量較其他藥材均低。這是因為不同藥材的習性各異、生長環境不同，造成acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量差異較大。3個苯乙醇苷成分總含量最高的為獨一味地上部分，達到了64.84mg/g，接下來依次為獨一味地下部分（8.18mg/g）、螃蟹甲地下部分（5.74mg/g）、糙蘇地上部分（5.59mg/g）、糙蘇地下部分（5.05mg/g），而蘿卜秦艽地下部分的總含量最低，為2.91mg/g。同一種藥材地上部分和地下部分3個苯乙醇苷成分總含量的高低差異還有待收集更多樣品進行比較。

綜上，本方法簡便、準確、重復性好，可以同時測定4種唇形科植物獨一味、糙蘇、螃蟹甲和蘿卜秦艽中3個苯乙醇苷成分——acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量。

[1]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草:第19卷[M].上海:上海科學技術出版社，1999:6074.

[2]李茂星.藏藥獨一味止血活性部位的研究[D].蘭州:蘭州大學，2008.

[3]張鳳，孫連娜，陳萬生.獨一味的化學成分及藥理作用[J].藥學實踐雜志，2008，26（3）:169.

[4]易進海，顏賢忠，羅澤淵，等.藏藥獨一味根化學成分的研究[J].藥學學報，1995，30（3）:206.

[5]Li MX，Shang XF，Jia ZP，et al.Phytochemical and biological studies of plants from the genus Phlomis[J].Chem Biodivers，2010，7（2）:283.

[6]于振喜.蘿卜秦艽化學成分及質量控制研究[D].北京:北京中醫藥大學，2006.

[7]靖會，佐建鋒，李教社.苯乙醇苷類化合物的藥理研究進展[J].時珍國醫國藥，2006，17（3）:440.

[8]許敬英，蘇奎，周靜.苯丙素苷類化合物的研究進展:Ⅱ[J].時珍國醫國藥，2007，18（7）:1770.

[9]宋光西，馬玲云，魏鋒，等.苯乙醇苷的分布及藥理活性研究進展[J].亞太傳統醫藥，2011，7（4）:169.