均勻設計法優選通心舒顆粒中藥材的提取工藝

劉 弘，王俊杰（解放軍第152中心醫院，河南 平頂山 467000）

通心舒顆粒是由人參、丹參、赤芍、當歸、川芎、黃芪等8味中藥組成的臨床驗方，具活血化瘀、行氣止痛之功效，臨床主要用于治療瘀血內停所致的胸痹心痛、胸悶刺痛等胸痹癥，療效顯著，不良反應少。為制定科學、合理的提取工藝，筆者根據處方中藥物的藥理作用及有效成分的理化性質，結合中醫配伍原則及臨床用藥特點，采用均勻設計安排試驗，以丹酚酸B、芍藥苷為指標成分，運用SPSS統計軟件處理試驗數據，優選通心舒顆粒水提工藝，為實際生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20 AT高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-20 ATvp溶劑輸送泵、SCIENCE AT-330柱溫箱、SIL-20 A自動進樣器、SPD-M20 A二極管陣列檢測器、LC solution色譜工作站（日本島津公司）。

1.2 藥材與試劑

處方中各藥材由解放軍第152中心醫院中藥房提供，經解放軍第152中心醫院趙國景副主任中藥師鑒定為真品；丹酚酸B、芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111562-200706、110753-200413）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 丹酚酸B、芍藥苷的含量測定

2.1.1 色譜條件[1-4]色譜柱:WondasilTM C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相:乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液（梯度洗脫程序見表1）；流速:0.8ml/min；柱溫:30Ⅸ；檢測波長:286（丹酚酸B）、230（芍藥苷）nm；進樣量:10μl。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 稱取丹酚酸B、芍藥苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為215、208μg/ml的混合對照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.1.3 供試品溶液的制備 精密吸取各提取液10ml，置25ml量瓶中，甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密量取丹酚酸B、芍藥苷混合對照品溶液2、6、10、14、15、20、25μl，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值。以對照品進樣量（x）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得丹酚酸B、芍藥苷的回歸方程分別為y＝1476174.7946 x－13688.9872（r＝0.9999）、y＝1506577.2003 x+78568.9644（r＝0.9998）。結果表明，丹酚酸B、芍藥苷的進樣量分別在0.416～4.160、0.430～5.375μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取丹酚酸B、芍藥苷混合對照品溶液適量，按上述色譜條件重復進樣測定6次，每次10μg。結果顯示，丹酚酸B、芍藥苷的RSD分別為1.29%、1.36%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取供試品溶液適量，分別在0、2、4、6、8、16、24h進樣10μl，按上述色譜條件測定。結果顯示，丹酚酸B、芍藥苷的RSD分別為1.72%、1.16%（n均為7），表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批提取液適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定6次，每次10μl，測定丹酚酸B、芍藥苷峰面積。結果，丹酚酸B、芍藥苷的RSD分別為0.83%、0.96%（n均為6），表明方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知丹酚酸B（3.2mg/g）、芍藥苷（1.3mg/g）含量的通心舒顆粒樣品1.5 g，共9份，精密加入樣品中各成分質量分數為80%、100%、120%的丹酚酸B、芍藥苷對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測定丹酚酸B、芍藥苷含量，并計算加樣回收率。結果表明，丹酚酸B、芍藥苷的平均加樣回收率分別為1.28%、0.51%，RSD分別為1.28%、0.51%（n均為9）。

2.2 均勻設計優選提取工藝

2.2.1 試驗設計 根據實際生產及相關文獻[5-6]，結合處方中各藥味的理化性質，先取處方量人參、丹參進行醇提，將醇提后殘渣與方中剩余處方量藥材混合，以加水倍數（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）、提取次數（D）為考察因素，前3個因素擬定為7個水平，提取次數擬定為3個水平；以丹酚酸B、芍藥苷轉移率（轉移率＝提取液中指標成分含量/藥材中指標成分含量×100%，1 g丹參中含丹酚酸B的量為56.5mg，1 g赤芍中含芍藥苷的量為22.0mg）和干膏得率（干膏得率＝干膏質量/干膏中所含藥材質量×100%）為評價指標，選擇均勻設計U7（73×3）表進行試驗。因素與水平見表2；均勻設計試驗結果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 均勻設計試驗結果Tab 3 Results of uniform design

2.2.2 數據處理及結果優化[7-9]中藥制劑成分復雜，對工藝的評價一般借助于試驗數據的優化處理。筆者采用層次分析加權法（AHP）優化試驗數據，通過分析處方配伍理論，根據“君臣佐使”原則，明確指標成分權重系數，計算初始權重系數并對其進行一致性檢驗（CR）。指標成分權重系數分配見表4。

表4 指標成分權重系數分配Tab 4 Distribution of weight coefficient of the components

根據表4安排，對各試驗結果計算綜合得分率，結果1～7號試驗的綜合得分率分別為76.58%、80.21%、61.57%、76.96%、42.55%、45.95%、91.75%。采用SPSS17.0統計軟件對上述試驗結果進行回歸分析，以各影響因素為自變量，以指標成分綜合得分為因變量，得回歸方程為Y＝－4.383+2.516 A－0.085 B+0.098 C+19.791 D，復相關系數R＝0.979，F＝11.639，P＜0.05，表明方程具有統計學意義。由方程可知，加水倍數、提取時間、提取次數與提取效果呈正相關，浸泡時間與提取效果呈負相關，且影響大小為提取次數＞加水倍數＞提取時間＞浸泡時間。結合各試驗水平下綜合得分結果，雖處方7得分最高，但考慮到實際生產條件及經濟性，最終確定最佳提取工藝為加9倍量的水，浸泡20min，提取3次，每次105min。

2.3 工藝驗證試驗

取人參、丹參醇提后殘渣與方中剩余處方量藥材混合，采用上述優選的工藝制備供試品溶液，再按“2.1”項下方法測定丹酚酸B、芍藥苷含量，計算干膏得率和各指標成分的轉移率。結果，各評價指標與正交試驗最高值相當，表明優選的工藝重復性好，穩定、可行。工藝驗證試驗結果見表5。

表5 工藝驗證試驗結果Tab 5 Results of validation test of technology

3 討論

中藥復方制劑成分復雜，在工藝篩選中選取單一成分作為指標，難免出現片面性。中醫藥理論指導下的中藥制劑，療效的發揮是多種有效成分共同作用的結果。因此，多指標共同考察工藝參數，不僅能反映制劑的工藝水平，且能在一定程度上反映所用藥材的質量，同時指標成分的分離測定還可以綜合反映傳統中藥組方的配伍狀況，這既考慮到中醫臨床用藥的習慣，又符合質量控制的要求。

均勻設計在中藥制劑工藝優選研究中應用廣泛，各試驗具備在試驗點范圍內充分的均勻分散的特點。因此，應保證試驗條件的可比性，準確選擇考察因素，恰當地確定各因素的考查范圍，合理劃分因素水平，同一因素各水平之間的差距應足夠大，水平之間的差距對評價指標的影響越顯著，回歸分析結果的精確性就越高；同時應該嚴格控制試驗誤差，均勻設計的結果才準確、可靠。本試驗在查閱相關文獻并結合實際生產的情況下，選取對提取效率影響較大的加水量、浸泡時間、提取時間及提取次數為因素，合理選擇各因素水平，通過優化分析，最終得出經濟、簡便、合理、實用的提取工藝。

采用AHP優化試驗數據，較其他方法更為科學、合理的解決綜合評價中權重系數選擇問題，但在層次分析時應注意一些不足和弊端:指標不能一味增大；AHP僅限于評價指標在9個之內；各指標的權重數值大小需結合專業知識及研究目的來確定，且需要進一步進行CR。SPSS統計軟件回歸分析結果可以很好地預測及確定最佳工藝水平，驗證試驗結果表明，選取的各參數準確、可靠。

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