正交試驗優(yōu)選板藍(lán)根多肽的提取工藝Δ

南楠，劉西京，侯安國（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，昆明 650500）

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效[1]。長期以來，研究人員對板藍(lán)根的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了大量的研究，部分研究認(rèn)為板藍(lán)根中的游離氨基酸是有效成分[2-3]。2010年版《中國藥典》（一部）也對板藍(lán)根中游離氨基酸進(jìn)行了定性鑒別[4]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根中多肽含量較高，經(jīng)人工胃腸液消化后，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法檢測發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根多肽被降解成小分子多肽，而不是降解成游離氨基酸。整體藥理試驗也表明，板藍(lán)根多肽有抗流感病毒的作用（另文發(fā)表），因此多肽可能為板藍(lán)根的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，故有必要對板藍(lán)根多肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。筆者采用正交試驗，以新版國家標(biāo)準(zhǔn)凱氏定氮法和2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二甲酸二鈉鹽（BCA）法測定多肽含量，考察提取溶劑、提取時間、溶劑用量對多肽提取的影響，并對這兩種測定方法進(jìn)行比較。

1 材料

1.1 儀器

KDN-04 A型半自動凱氏定氮儀（上海貝特儀電設(shè)備廠）；Multiskan spectrum全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；96孔板（美國康寧公司）；MF1-A10超純水機（美國Millipore公司）；5180 R高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥材

板藍(lán)根，2011年10月購自甘肅，經(jīng)湖南省中醫(yī)研究院劉春海副研究員鑒定為真品。

1.3 試劑

BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，碧云天生物技術(shù)研究所）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的提取

板藍(lán)根藥材適當(dāng)粉碎，過40目篩，稱取50 g，按試驗安排在常溫下進(jìn)行浸取。用紗布粗濾，以離心半徑為8 cm、6000 r/min離心10min，取上清液。平行試驗2次。

2.2 板藍(lán)根多肽的含量測定

2.2.1 凱氏定氮法 按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2010版凱氏定氮法，精密吸取上清液10ml，依法測定板藍(lán)根浸提液中多肽含量，計算多肽得率（多肽得率＝提取的多肽質(zhì)量/板藍(lán)根質(zhì)量×100%）。

2.2.2 BCA法 別精密吸取1、2、4、8、12、20μl的1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)液，加于96孔板中，加水補足20μl，各孔加入200μl BCA工作液，放入酶標(biāo)儀中，在562nm波長下檢測。設(shè)定程序如下:振蕩30 s，在37Ⅸ下孵育15min。以BSA質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.010 x+0.146（r＝0.9989）。結(jié)果表明，BSA質(zhì)量濃度在0～90.909μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 樣品含量測定 精密吸取上清液40μl，加超純水于1ml量瓶中，吸取20μl加入96孔板中，然后加入200μl BCA工作液，按“2.2.1”、“2.2.2”項下方法測定。

2.3 正交試驗優(yōu)選工藝

根據(jù)預(yù)試驗和筆者經(jīng)驗，選取溶劑種類（A）、提取時間（B）、溶劑用量（C）為考察因素，以多肽得率為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗。因素與水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance

由表2、表3可知，采用凱氏定氮法測定時，各因素對多肽得率的影響順序為B＞A＞C，因素A、B對多肽得率的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），最佳提取工藝為A1B3C3，即用15倍量超純水浸泡24h。采用BCA法測定時，各因素對多肽得率的影響順序為A＞C＞B，其中因素A對多肽得率的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），最佳提取條件為A1B1C3，即用15倍量超純水浸泡6h。考慮到在BCA法中B對結(jié)果的影響最小，而在凱氏定氮法中B對結(jié)果有較大影響，綜合考慮，選取最佳提取工藝為A1B3C3，即用15倍量超純水浸泡24h。

2.4 工藝驗證試驗

取5000 g板藍(lán)根藥材粗粉，共3份，按上述優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，照凱氏定氮法和BCA法測定多肽得率。結(jié)果，多肽得率分別為10.58%和6.32%，收率可達(dá)70%以上，表明所選工藝穩(wěn)定、可行，可用于板藍(lán)根中多肽的提取。

3 討論

蛋白或多肽的測定方法有多種，又各有優(yōu)缺點[5-9]，如紫外吸收法操作簡便快速，但準(zhǔn)確度較差；Folin-酚試劑法靈敏度高，對蛋白質(zhì)和分子質(zhì)量較小的多肽具有同樣的顯色反應(yīng)，但干擾物較多，檢出的蛋白含量往往偏高；考馬斯亮藍(lán)法靈敏度高，但標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)選擇困難，且對于大量多肽成分存在的溶液不宜用；雙縮脲法靈敏度較低，需要的樣品量大；凱氏定氮法是測定蛋白或多肽最經(jīng)典的方法，但本法耗時較長，且含氮的非蛋白質(zhì)化合物、游離氨基酸等干擾物在樣品中普遍存在；BCA法靈敏度高，對于溶液中低含量的多肽也可檢出，且干擾物質(zhì)少。

筆者根據(jù)板藍(lán)根的特性，選擇凱氏定氮法與BCA法同時測定蛋白質(zhì)含量，相互驗證，以求結(jié)果的準(zhǔn)確、科學(xué)。從試驗結(jié)果可以看出，兩種方法測得的多肽得率相近，凱氏定氮法結(jié)果稍偏高，原因是板藍(lán)根浸提液里除了蛋白質(zhì)和多肽外，還含有很多含氮化合物，如生物堿、核苷類、游離氨基酸類等，換言之，凱氏定氮法的結(jié)果是多肽、生物堿、核苷類、游離氨基酸的總和，故測量值偏高。BCA法靈敏度高，干擾少，測定結(jié)果相對較準(zhǔn)確。兩種方法的測定結(jié)果差距不大，也說明了在提取液中多肽的含量較高。筆者所在課題組已證實多肽有一定的抗流感病毒作用，因此其在板藍(lán)根“清熱解毒”中的作用不應(yīng)忽視。

一般來說，堿性蛋白或肽采用酸性緩沖溶液提取，酸性蛋白或肽采用堿性緩沖液提取。試驗中因不能確定板藍(lán)根中肽的等電點，因此在正交試驗設(shè)計中采用pH8.0和pH6.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行提取，測量酸堿兩性緩沖溶液和超純水對總蛋白提取效率的影響。結(jié)果顯示，無論凱氏定氮法還是BCA法，K2A結(jié)果較K3A均偏低，說明偏堿性緩沖液比偏酸性緩沖液提取的多肽得率低，推測板藍(lán)根酸性蛋白或肽含量可能低于堿性蛋白或肽。

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