α-Klotho蛋白在腎性繼發性甲狀旁腺功能亢進中的作用

閆軍放 綜述 郝 麗，張 凌 審校

繼發性甲狀旁腺功能亢進(secondary hyperparathyroidism，SHPT)是慢性腎臟病－礦物質和骨代謝紊亂(chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)最常見的一種表現形式，是慢性腎臟病最常見并發癥之一。早期主要表現為血清生化指標的異常，如鈣、磷代謝紊亂及甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)升高，臨床癥狀多不明顯。隨著病情進展，逐漸發展成持續性或難治性SHPT［1］，除出現難以控制的鈣磷代謝紊亂及PTH升高外，臨床上還可表現為:①骨病:骨痛、骨折、急性關節周圍炎、自發性肌腱斷裂及肌肉軟弱、肌病等;②心血管系統損傷:血管及心臟瓣膜鈣化、心血管結構和功能的改變、心源性猝死等;③ 皮膚損傷:包括皮膚鈣化、瘙癢、潰瘍形成及組織壞死等;④鈣化防御，即鈣化性尿毒癥動脈病變(calcific-uremicarterriolopathy，CUA);⑤ 其他如貧血、生長遲緩、失眠、不安腿綜合征等［2－3］。嚴重病例可表現為退縮人綜合征［4］(shrinking man syndrome，SMS)、Sagliker綜合征［5－6］。SHPT 與原有腎臟病構成惡性循環，嚴重影響患者的生存及預后。

SHPT發病機制目前尚未完全明確，傳統觀點認為其機制主要為各種原因引起的低鈣、高磷刺激甲狀旁腺合成并分泌PTH［7］。目前認為抗衰老蛋白α-Klotho(以區別于后來在腸道內發現的 β-Klotho，下文中Klotho即指α-Klotho)在調節鈣磷代謝及SHPT發展中起著重要作用［8］。

1 Klotho蛋白簡介

Klotho基因是新發現的與人類衰老相關的基因，于1997年由 Kuro-o et al［9］在研究自發型高血壓時發現。人類Klotho基因定位于染色體13q12區域，全長50 kbp，由4個內含子和5個外顯子組成。研究［10］表明，Klotho基因 mRNA第三外顯子有一內在選擇性剪切位點，50 bp片段插入該剪切位點，其RNA只表達3個外顯子，從而編碼可溶性Klotho蛋白(sKlotho)，又稱分泌型Klotho或循環型Klotho，其約549個氨基酸，存在于血液、尿液、腦脊液中，以游離形式發揮生物學效應;如果該剪切位點沒有接受50 bp片段插入，其外顯子全部表達而編碼模型Klotho蛋白，這種模型蛋白為一次性跨膜蛋白，含有1 012個氨基酸，包括N端信號序列、胞內區、跨膜區和胞外區(含有兩個重復序列 KLl、KL2)。KL1和KL2含有550個氨基酸，和β-糖苷酶同源。KL1和KL2之間含有Lys-Lys-Arg-Lys序列，此為蛋白水解酶的作用位點。如被蛋白水解酶水解，則胞外區脫落形成分泌型蛋白(缺少 KL2、跨膜區和胞內區)。目前研究［11］顯示，分泌型Klotho蛋白，即循環中的Klotho蛋白有3種來源:Klotho基因直接編碼;膜型Klotho蛋白水解片段脫落入血;Klotho蛋白通過與Na+/K+-ATP酶結合從內質網和高爾基體上轉移至細胞膜表面，之后被水解。

2 模型Klotho蛋白在SHPT發生發展中的作用

Klotho蛋白主要在腎臟和甲狀旁腺中表達。Klotho蛋白作為 FGF23需輔助受體，可以調節FGF23 4種受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3和 FGFR4)的活性，使受體由低親和力的特性轉化為高親和力［12］，與 FGF23結合形成所謂的 FGF23-Klotho軸［13］，在調節鈣磷代謝、PTH生成及分泌中起著重要作用。見圖1。

圖1 組織與循環Klotho蛋白在甲狀旁腺及腎臟作用示意圖

2.1 Klotho蛋白在腎臟中的作用 Klotho蛋白在腎臟可與FGF23協同，抑制腎臟近端小管對磷的重吸收。和FGFR受體相互作用，抑制25(OH)-維生素D-1α羥化酶，減少1，25(OH)2D3(活性維生素D3)的生成，并促進其滅活，進而調節機體的鈣磷代謝。在腎臟，Klotho蛋白主要表達在遠端小管，且此段小管表達FGFR1，說明腎遠端小管可能是FGF23的效應部位［14］。但腎臟重吸收磷的部位主要在近端腎小管，而非遠端腎小管。針對這一矛盾現象，可能的解釋之一是分泌型sKlotho蛋白在腎臟內或腎臟外部出現轉移，當sKlotho蛋白以及FGF23到達腎臟近端小管后，與近端小管上表達的FGFR3結合，從而發揮抑制近端小管重吸收磷的作用［15］。

2.2 Klotho在甲狀旁腺中的作用 Klotho蛋白在甲狀旁腺中的作用更加復雜。甲狀旁腺組織表達Klotho蛋白及 FGFR，目前已經證實甲狀旁腺是FGF23的靶器官［16］。在甲狀旁腺組織中，FGF23可在受體水平與Klotho蛋白結合作用于甲狀旁腺，調節PTH的生成與分泌。體內實驗及離體實驗均證實，Klotho蛋白能夠使FGFR由低親和力受體轉化為高親和力受體，與FGF23結合后，發揮FGF23對甲狀旁腺細胞內PTH mRNA表達及PTH分泌的抑制效應。由此可見，FGF23發揮生物學效應需要Klotho蛋白存在，Klotho蛋白與 FGF23結合形成FGF23-Klotho軸。在此通路中 Klotho蛋白作為FGF23受體活化所必須的輔助因子，是必需輔助受體，在抑制PTH生成與分泌中起著重要作用。

大量的臨床研究［1，7］觀察慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者，特別是終末期 CKD患者，血清FGF23水平通常顯著增高，同時伴有血清PTH的高表達，這一現象與FGF23能夠降低血PTH水平的理論相悖。目前多項實驗證據［17－18］證實，血清FGF23與PTH呈正相關。基于CKD患者血清FGF23水平與 PTH 呈正相關現象，Komaba et al［19］研究發現血清FGF23對PTH分泌抑制作用的減弱可能與Klotho、FGFR mRNA表達下降以及細胞增生標志物Ki67的上調有關，并認為甲狀旁腺組織可能存在FGF23抵抗。同時Kumata et al［20］通過對離體后增生的甲狀旁腺組織研究，也發現增生的甲狀旁腺組織中Klotho、FGFR1c表達減少，鈣敏感受體CaR表達亦下降，Klotho、FGFR1c與CaR表達呈正相關;同時細胞增生標志物Ki67表達亦上調。另外在結節性甲狀旁腺組織Klotho蛋白及FGFR1c表達較彌漫性增生的甲狀旁腺上的表達顯著減少，此種現象說明隨著SHPT病情進展，甲狀旁腺腺體發生組織學改變，其組織中Klotho蛋白及FGFR1c表達逐漸減少。于是筆者認為增生的甲狀旁腺Klotho及FGFR1c表達下降可能為FGF23抵抗的原因之一。針對甲狀旁腺組織Klotho及FGFR與血清參數(如血清鈣、磷、PTH等)之間的關系，因研究納入的SHPT病例比較少(n=12)，且多個甲狀旁腺腺體可能來自同一病例，不能確定所選的甲狀旁腺腺體是否能夠真實反應該病例，故在該研究中無法進行分析。

在甲狀旁腺組織，Klotho蛋白不僅能通過與FGF23結合形成FGF23-Klotho軸發揮抑制PTH合成及分泌的作用，還可不依賴于FGF23，直接調節PTH合成、分泌。其機制是Klotho蛋白通過與甲狀旁腺組織中Na+/K+-ATP酶的α1-亞單位分子間的相互作用，直接作用于Na+/K+-ATP酶，進而促進PTH合成及分泌［21］。然而CKD患者SHPT卻不斷進展，“甲狀旁腺內存在陰－陽狀態”這種假設或許能夠解釋這種現象［15］:在陰的狀態時，雖然FGF23-FGFR途徑對PTH分泌有抑制作用，但Klotho-Na+/K+-ATP酶途徑完全激活，反而加強了PTH的分泌;相反在陽的狀態時，由于Klotho蛋白下降，FGF23-FGFR途徑抑制PTH分泌的作用不能完全發揮，導致PTH分泌增加，而Klotho-Na+/K+-ATP酶途徑活性的下降不能抵消前者引起的PTH的增加，最終引起高水平的PTH。這種假設的基礎是機體對PTH的合成及分泌有不斷地刺激，而反調解機制僅部分有效。

3 sKlotho蛋白在SHPT中的作用

sKlotho蛋白以旁分泌和自分泌的形式發揮生物學效應［22］。

3.1 sKlotho作為激素作用于全身多個組織、器官

sKlotho蛋白作為一種激素，其靶目標為多種組織、器官，可發揮抗衰老、抑制細胞凋亡、心血管保護、調節血壓、減少氧化應激以及避免腎臟纖維化等作用［23］。sKlotho蛋白減少，可誘發或加重心血管鈣化等，進一步加重SHPT對患者的影響。

3.2 sKlotho以旁分泌形式發揮生理學效應 研究［24］顯示Klotho蛋白具有 β-葡糖醛酸酶活性，其能通過旁分泌形式調解瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV5)和K+通道ROMK。TRPV5是腎臟遠曲小管上皮細胞膜上的鈣離子通道，是腎臟重吸收鈣的部位。研究［25］表明，重組Klotho蛋白能夠增強人胚腎細胞(HEK293)鈣內流以及細胞表面TRPV5的表達。其能夠水解TRPV5 N-寡聚糖鏈末端的唾液酸，末端唾液酸使半乳素1與TRPV5結合，結果使TRPV5的內化減少，TRPV5在上皮細胞膜表面的潴留增加。因此，Klotho蛋白的存在使腎臟對鈣離子重吸收增加，以維持正常水平的血鈣濃度。如前所述，在腎臟，Klotho蛋白可以與FGF23在腎臟近端小管與FGFR3相互作用，抑制腎臟對磷的重吸收。另外，sKlotho還可不依賴于FGF23，直接作用于腎近端小管刷狀緣膜鈉磷共轉運體2a型(NaPi-2a)以及腸內NaPi-2b轉運體，使兩者表達及活性受到抑制，從而限制體內磷的重吸收，避免高磷血癥的發生［26－27］。而對于 CKD 特別是尿毒癥患者，由于DNA轉甲基酶表達增加，DNA甲基化，導致CKD患者Klotho蛋白表達量較健康人群明顯下降［28］，且隨著CKD 進展Klotho漸減少［29－30］。減少的Klotho蛋白對鈣重吸收以及抑制磷重吸收作用均明顯減弱，導致低鈣、高磷血癥，最終引起SHPT的發生與發展。

4 小結

隨著對Klotho蛋白研究的不斷深入，其在腎性SHPT發生發展中的作用正被逐漸認識。目前已知Klotho蛋白能夠以模型Klotho以及分泌型sKlotho形式，通過FGF23依賴以及非FGF23依賴的途徑，調節鈣磷代謝以及PTH合成及分泌，其與SHPT之間的關系正被不斷地闡明。盡管如此，但仍有諸多問題，如Klotho蛋白、FGFR1c與甲狀旁腺細胞增生及PTH合成、分泌之間確切的關系，以及SHPT中Klotho基因表達的調控機制、Klotho蛋白具體的傳導信號等，目前尚不完全清楚，需要更進一步的研究。

［1］Nakanishi S，Kazama J J，Nii-Kono T，et al.Serum fibroblast factor-23 levels predict the future refractory hyperparathyroidism in dialysis patients［J］.Kidney Int，2005，67(3):1171 －8.

［2］Lishmanov A，Dorairajan S，Pak Y，et al.Elevated serum parathyroid hormone is a cardiovascular risk factor in moderate chronic kidney disease［J］.Int Urol Nephrol，2012，44(2):541 －7.

［3］Van Ballegooijen A J，Reinders I，Visser M，et al.Parathyroid hormone and cardiovascular disease events:A systematic review and meta-analysis of prospective studies［J］.Am Heart J，2013，165(5):655－64.

［4］Horensten M L，Boner G，Rosenfeld J B.The shrinking man:A manifestation of severe renal osteodystrophy［J］.JAMA，1980，244(3):267－8.

［5］Sagliker Y，Balal M，Sagliker Ozkaynak P，et al.Sagliker syndrome:uglifying human face appearance in late and severe secondary hyperparathyroidism in chronic renal failure［J］.Semin Nephrol，2004，24(5):449 －55.

［6］Zhang L，Yao L，Bian W J，et al.Severe uremic leontiasis ossea ameliorated by total parathyroidectomy［J］.Kidney Int，2009，76(10):1118.

［7］Slatopolsky E，Dusso A，Brown A J.The role of phosphorus in the development of secondary hyperparathyroidism and parathyroid cell proliferation in chronic renal failure［J］.Am J Med Sci，1999，317(6):370－6.

［8］Hu M C，Kuro-o M，Moe O W.Klotho and chronic kidney disease［J］.Contrib Nephrol，2013，180:47 －63.

［9］Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing［J］.Nature，1997，390(6655):45－51.

［10］Imura A，Aiwano A，Tohyama O，et al.Secreted Klotho protein in sera and CSF:implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane［J］.FEBS Lett，2004，565(1－3):143－7.

［11］Wang Y H，Sun Z J.Current understanding of klotho［J］.Ageing Ras Rev，2009，8(1):43－51.

［12］Urakawa I，Yamazaki Y，Shimada T，et al.Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23［J］.Nature，2006，444(7120):770－4.

［13］Koizumi M，Komaba H，Fukagawa M.Parathyroid function in chronic kidney disease:role of FGF23-Klotho axis［J］.Contrib Nephrol，2013，180:110 －23.

［14］Liu S，Vierthaler L，Tang W，et al.FGFR3 and FGFR4 do not mediate renal effects of FGF23［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(12):2342－50.

［15］Drüeke T B.Klotho，FGF23，and FGF receptors in chronic kidney disease:a yin-yang situation?［J］.Kidney Int，2010，78(11):1057－60.

［16］Ben-Dov I Z，Galitzer H，Lavi-Moshayoff V，et al.The parathyroid is a target organ for FGF23 in rats［J］.J Clin Invest，2007，117(12):4003－8.

［17］Isakova I，Gunerrez O M，Wolf M.A blueprint for randomized trials targeting phosphorus metabolism in chronic kidney disease［J］.Kidney Int，2009，76(7):705 －16.

［18］Komaba H，Fukagawa M.FGF23-Parathyroid interaction:implications in chronic kidney disease［J］.Kidney Int，2010，77(4):292－8.

［19］Komaba H，Goto S，Fujii H，et al.Depressed expression of Klotho and FGF receptor 1 in hyperplastic parathyroid glands from uremic patients［J］.Kidney Int，2010，77(3):232 － 8.

［20］Kumata C，Mizobuchi M，Ogata H，et al.Involvement of Alpha-Klotho and fibroblast growth factor receptor in the development of secondary hyperparathyroidism［J］.Am J Nephrol，2010，31(3):230－8.

［21］Imura A，Tsuji Y，Murata M，et al.α-klotho as a regulator of calcium homeostasis［J］.Science，2007，316(5831):1615 － 8.

［22］Drüeke T B，Massy Z A.Circulating Klotho levels:clinical relevance and relationship with tissue Klotho expression［J］.Kidney Int，2012，83(1):13 －5.

［23］Kuro-o M.Klotho in health and disease［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2012，21(4):362 －8.

［24］Huang C L.Regulation of ion channels by secreted Klotho:mechanisms and implications［J］.Kidney Int，2010，77(10):855 －60.

［25］Cha S K，Ortega B，Kuresu H，et al.Removal of sialie acid involring Klotho cm.18e6 eell·sndace retention of TRPV5 channel via binding to galeetill-1［J］.Proe Natl Aead Sci USA，2008，105(28):9805－10.

［26］Hu M C，Shi M，Zhang J，et al.Klotho:a novel phosphaturic substance acting as an autocrine enzyme in the renal proximal tubule［J］.FASEB J，2010，24(9):3438 －50.

［27］Dermaku-Sopjani M，Sopjani M，Saxena A，et al.Downregulation of NaPi-IIa and NaPi-IIb Na-coupled phosphate transporters by coexpression of Klotho［J］.Cell Physiol Biochem，2011，28(2):251－8.

［28］Sun C Y，Chang S C，Wu M S.Suppression of Klotho expression by protein-bound uremic toxins is associated with increased DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation［J］.Kidney Int，2012，81(7):640 －50.

［29］Akimoto T，Yoshizawa H，Watanabe Y，et al.Characteristics of urinary and serum soluble Klotho protein in patients with different degrees of chronic kidney disease［J］.BMC Nephrology，2012，23(13):155－63.

［30］Yokoyama K，Imura A，Ohkido I，et al.Serum soluble α-klotho in hemodialysis patients［J］.Clin Nephrol，2012，77(5):347 －51.