含有CRISPR序列的噬菌體耐受菌的篩選

滑玉會，黃 勇，張志毅，安小平，米志強，尹秀云，陳建魁，童貽剛

規律成簇的間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是細菌內存在的專門針對噬菌體及質粒等外源基因的獲得性免疫系統［1］，這種抗性作用的發揮類似于真核生物中的RNA干擾作用。在噬菌體治療過程中，細菌往往會對噬菌體產生耐受，導致耐受噬菌體的菌株出現。關于噬菌體耐受菌株的篩選，國內外已有較多的研究［1－2］，如通過篩選嗜熱鏈球菌抗噬菌體突變株來提高發酵酸奶的生產性能，以及通過篩選噬菌體耐受菌來研究細菌耐受噬菌體的機制。該研究通過PCR方法篩選含有CRISPR系統的大腸埃希菌，以含有CRISPR系統的大腸埃希菌為指示菌分離噬菌體，進而在人為條件下篩選出耐受噬菌體的大腸埃希菌，擬利用這些細菌分析噬菌體和CRSIPR系統之間的關系，為進一步了解CRISPR的作用特點和提高噬菌體治療效果提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 臨床分離的70株致病性大腸埃希菌來自于軍事醫學科學院附屬307醫院檢驗科，用于分離噬菌體以及篩選噬菌體耐受株;PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;膠回收試劑盒購自天津寶瑞生物技術有限公司;LB培養基:胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，用蒸餾水定容至1 L，調至 pH 7.0，121 ℃ 下高壓滅菌 20 min。固體LB培養基需添加1.5%瓊脂粉，半固體LB培養基需添加0.75%瓊脂粉。SM緩沖液:氯化鈉5.8 g，硫酸鎂2.0 g，pH 7.5，1 mol/L Tris-HCl 50 ml，2%明膠5 ml，加水至1 L;化學試劑均為國產分析純;2720型PCR儀(ABI公司);DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠);BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像系統。

1.2 含有CRISPR系統大腸埃希菌的篩選 根據CRISPR database(http://crispr.u-psud.fr/crispr/)公布的E.coli菌株的CRISPR序列特征，利用網站中FlankAlign選項的 Flanking sequence Alignement Tool，分別選取200 bp長度的大腸埃希菌CRISPR序列right flanking sequence和left flanking sequence，按照同源性比對結果將其分為15個組，將每組對應的序列導入到CLC軟件里，分別得到一個consensus序列，利用NCBI網站上的primer-blast功能，設置各種參數，經過引物特異性檢測，只有4對引物符合要求。P10(F:TACCGTTGGTGAAGGAGCTG，R:TTCCGGTGGATTTGGATGGG)、P13(F:TTGAGTTTCAGA CCTGGGGC，R:TGCTACCGTTGGTGAAGGAG)、P14(F:CTGGGAGTTCTACCGCAGAG，R:CCCCGGAGTATTTGGATGGT)、P15(F:GGAAAATGGGAGCTGGGTGT，R:ACCTGGGGAGAAAACAGACG)。采用PCR法對供試菌株進行CRISPR序列擴增，反應體系參照PCR試劑盒使用說明，回收PCR產物并測序。

1.3 相關噬菌體的分離 以含有CRISPR的菌株E.coli 147-30為指示菌，于軍事醫學科學院附屬307醫院污水處理處收集未經消毒處理的污水，12 209 r/min離心2次，每次10 min以除去固體雜質，收集上清液;用0.22 μm濾器過濾除菌，取4 ml濾液加入2 ml經高壓滅菌的3×LB培養基中，接種500 μl過夜培養的宿主菌E.coli 147-30，混合均勻后置于搖床內，37℃過夜培養。12 209 r/min離心10 min收集上清液，0.22 μm濾器過濾，濾液即為含有噬菌體的原液。

將噬菌體原液10倍梯度稀釋，分別取各梯度噬菌體稀釋液100 μl和500 μl對數期的宿主菌混合均勻后，室溫放置10 min以使其充分吸附后加入45℃上層半固體培養基5 ml，混合均勻，然后傾倒入固體培養基平板上，凝固后置于37℃培養，觀察噬菌斑的出現。用無菌槍頭從噬菌斑分布均勻的平板上挑取單個噬菌斑，加入到對數期的宿主菌中，置于37℃搖床中培養6 h，12 209 r/min離心10 min，0.22 μm濾器過濾，濾液置于4℃保存。重復以上步驟3～4次，以得到大小和形態保持一致的噬菌斑。

噬菌體形態的電鏡觀察:將保存在SM緩沖液中的噬菌體滴在覆有碳膜的銅網上，室溫晾干后用濾紙吸去未經吸附的溶液;滴一滴磷鎢酸(PTA)染色2 min，用濾紙吸去多余的液體;室溫干燥后用HITACHI HT7700型透射電子顯微鏡進行觀察，記錄噬菌體顆粒的形態和大小。

1.4 大腸埃希菌噬菌體耐受株的篩選 采用PEG沉淀的方法［3］濃縮噬菌體IME-EC1以使其達到一個較高的滴度(約1010PFU/ml)，大腸埃希菌噬菌體耐受株的篩選參照文獻［4－5］報道，具體方法簡述如下:將過夜培養的宿主菌進行10倍梯度稀釋，然后分別取各梯度稀釋液100 μl分別與100 μl噬菌體懸液(1010PFU/ml)混合均勻，吸附10 min后加入到45℃上層半固體培養基中，混合均勻，然后傾倒入固體培養基平板上，凝固后置于37℃培養24 h至單克隆出現。

隨機挑取平板上產生的單克隆，加入到5 ml經高壓滅菌的LB液體培養基中，置于37℃中過夜培養，采用點滴法［6］來鑒定單克隆對噬菌體是否產生了真正的耐受以及耐受能否穩定的保持到下一代細菌，具體步驟為:將培養至對數期的敏感菌和耐受菌分別加入到融化的半固體LB培養基中，待凝固后，取2 μl的噬菌體原液滴在雙層平板上，待平板晾干后倒置于37℃培養觀察噬菌斑的有無。敏感菌的平板上能夠產生比較透亮的噬菌斑，而耐受菌的平板上，由于耐受菌對噬菌體不再敏感，則不會產生噬菌斑。

2 結果

2.1 含有CRISPR系統大腸埃希菌的篩選 采用菌落 PCR的方法，分別采用 4對人工設計的CRISPR特異性引物對70株大腸埃希菌的CRISPR序列進行擴增，結果從70株供試菌株中檢測到42株大腸埃希菌中含有CRISPR序列，見表1。選擇其中1株大腸埃希菌(E.coli 147-30)用于后續相關噬菌體的分離以及噬菌體耐受菌篩選實驗。見圖1。設計的4對特異性引物中，有3對引物(10、13、15)擴增出CRISPR序列。將E.coli 147-30的PCR產物直接進行序列分析，結果顯示該3對引物擴增的序列互相重疊，可以拼接成一個較長的contig序列，用 CRISPR database 網站(http://crispr.u-psud.fr/crispr/)中CRISPR Finder功能分析該CRISPR序列結構特征，顯示該位點共有18個重復單元，其中重復序列長為29 bp，序列為CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC，間隔序列長為32 bp，見表2。

圖1 E.coli 147-30的CRISPR序列擴增結果

2.2 相關噬菌體的分離 以含有CRISPR的菌株E.coli 147-30為指示菌，于軍事醫學科學院附屬醫院未經消毒處理的污水分離到1株噬菌體，命名為IME-EC1，噬菌斑的大小不均一，如針孔狀并且透明，見圖2。純化后的噬菌體IME-EC1經負染后在透射電鏡下的形態見圖3。該噬菌體呈蝌蚪形，具有典型的二十面體結構，頭部寬約70 nm，長約100 nm，尾部長約115 nm，尾部底端具有數根尾絲，屬于肌尾噬菌體科。

2.3 大腸埃希菌噬菌體耐受株的篩選 采用PEG沉淀的方法濃縮噬菌體 IME-EC1，滴度約為1010PFU/ml。用濃縮得到的高滴度噬菌體篩選得到了大腸埃希菌噬菌體耐受菌，采用點滴法鑒定篩選得到的耐受菌，見圖4。由于147-30R1對噬菌體產生了耐受性，所以平板上沒有發現透亮的噬菌斑。選用其中1株噬菌體耐受菌(命名為147-30R1)用于后續實驗的研究。147-30R1在連續培養數代以后能夠繼續穩定保持對噬菌體IME-EC1的耐受。

表1 CRISPR序列在大腸埃希菌中的分布情況

表2 E.coli 147-30的CRISPR序列相關信息

圖2 噬菌斑的形態

圖3 噬菌體在電鏡下的形態 ×40 000

圖4 點滴法鑒定噬菌體耐受菌

3 討論

在細菌和古細菌中廣泛存在CRISPR-Cas獲得性免系統是新發現的一個機制，該機制能夠限制相應噬菌體、質粒等外源DNA的入侵。研究［1］表明CRISPR系統能夠為Streptococcus thermophiles提供抵抗噬菌體感染的獲得性免疫，顯示了間隔序列和噬菌體基因組序列之間存在同源性。在噬菌體、質粒等外源性DNA入侵的過程中，新的重復序列(repeats，R)－間區序列(spacers，S)片段被獲得并被插入到前導序列和原來第一個重復序列之間，從而使宿主獲得抵抗相應噬菌體、質粒等再次入侵的獲得性免疫能力。目前，CRISPR系統作為一種能夠抵御噬菌體感染的防御機制，對其作用的其他分子作用機制并不十分了解。

為了更清楚的研究細菌耐受噬菌體現象和CRISPR系統之間的相互關系，根據CRISPR database數據庫中已經公布的大腸埃希菌的CRISPR序列的信息，依據其Flanking sequence的同源性比對結果設計了4對特異性的引物，對4對引物篩選出的CRISPR序列進行分析發現，4對引物所擴增的CRISPR序列其實是一個CRISPR位點，但是由于菌株自身的差異導致其與每條引物結合的特異性不同，所以才會出現有些引物呈陽性，有些引物為陰性的結果，這與后期序列分析結果吻合。首先從本實驗室保存的細菌庫中成功篩選到42株含有CRISPR序列的大腸埃希菌，然后又以含有CRISPR序列的大腸埃希菌為指示菌分離得到了相應的噬菌體IME-EC1，成功篩選了含有CRISPR序列的噬菌體耐受菌，為后續研究CRISPR系統與細菌耐受噬菌體現象之間的相互關系打下了基礎。在噬菌體IMEEC1的培養過程中，發現在平板上產生的噬菌斑的大小常不均一，這可能與培養基pH、瓊脂濃度、宿主菌的濃度、培養溫度、培養時間有關，即使是在同一培養條件下、同一平板上的噬菌斑大小也常不一致。另外，已經完成了對噬菌體敏感菌E.coli 147-30和耐受菌E.coli 147-30R1的全基因組測序，以分析噬菌體耐受菌中CRISPR系統的序列特征，期望從分子機制上解釋噬菌體耐受菌出現的原因，相關的生物信息學分析工作正在進行。

總之，成功建立了篩選含有CRISPR序列的大腸埃希菌的方法，從70株大腸埃希菌中篩選到42株含有CRISPR序列的細菌，篩選率達到60%。序列分析顯示篩選的E.coli 147-30大腸埃希菌中所含有的CRISPR序列在數據庫中是獨特的，這也豐富了大腸埃希菌中CRISPR序列的信息資源。同時篩選到含有CRISPR序列的噬菌體耐受菌，敏感菌和耐受菌中所含有的巨大的序列信息對以后更加深入的研究細菌耐受噬菌體的現象提供了基礎數據。

［1］Barrangou R，Fremaux C，Deveau H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes［J］.Science，2007，315(5819):1709 －12.

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［3］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2002:186－7.

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