小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚抗血小板聚集研究

孫愛華，周碧蓉

氯吡格雷是血小板聚集抑制劑，被廣泛用于血栓和動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的治療［1］。臨床資料［2］表明:氯吡格雷可以明顯降低血栓發生率，減少動脈粥樣硬化的發生，但其在腸道吸收受P－糖蛋白干擾［3］，治療給藥存在一定抵抗現象，療效不穩定;同時常規用藥所致胃腸道出血和肝腎功能損傷等不良反應發生頻率較高［4］，且嚴重程度往往呈現出一定劑量依耐性［5］，從而限制其臨床應用。丹皮酚是牡丹干燥根皮的活性成分，可抑制血小板聚集［6］，也可抑制 P-糖蛋白［7］活性，提示氯吡格雷和丹皮酚聯合給藥可能具有協同效應。故該研究初步考察小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥抗血小板聚集作用是否優于單用氯吡格雷，旨在為二者臨床聯合給藥提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 硫酸氯吡格雷片，25 mg/片，深圳信立泰藥業，批號:20090312;丹皮酚(宣城百草植物工貿有限公司，純度99%，批號:100321);氯吡格雷和丹皮酚臨用前均用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解;二磷酸腺苷二鈉(adenosine diphosphate，ADP)，上海伯奧生物技術有限公司，批號:20100430。

1.2 實驗儀器 GL20A高速冷凍離心機:湖南儀器儀表總廠離心機廠;PHS-2C酸度計:上海理達儀器廠;AA-200DS電子分析天平:Denver儀器公司;LBY-NJ2血小板凝聚儀:北京普利生公司;－80℃超低溫冰箱:美國 Advantage公司;SYS-MEX XT-1800i全自動血液自動分析裝置:日本KOBE公司。

1.3 實驗動物與分組 SD大鼠，雄性，體重(240±20)g，清潔級;昆明種小鼠，雄性，體重(20±2)g;實驗動物均由安徽醫科大學實驗動物中心提供。實驗大鼠隨機分為5組，分別為正常組、丹皮酚組(50 mg/kg)、小劑量氯吡格雷組(3 mg/kg)、氯吡格雷常規劑量組(6 mg/kg)和氯吡格雷(3 mg/kg)+丹皮酚(50 mg/kg)聯合給藥組;實驗小鼠隨機分為5組，分別為正常組、丹皮酚組(70 mg/kg)、小劑量氯吡格雷組(4.5 mg/kg)、氯吡格雷常規劑量組(9 mg/kg)和氯吡格雷(4.5 mg/kg)+丹皮酚(70 mg/kg)聯合給藥組。各給藥組每天灌胃1次，連續給藥1周，正常組大鼠和小鼠給予等體積溶媒。

1.4 實驗方法［8］

1.4.1 大鼠血小板聚集抑制率 SD大鼠40只隨機分為5組，實驗前12 h禁食不禁水。各給藥組末次給藥2 h后，腹主動脈取血，枸櫞酸鈉溶液(3.8%)與血液按照1∶9混合，800 r/min離心10 min，獲得富含血小板血漿;3 000 r/min離心10 min制備貧血小板血漿。調整富血小板血漿中血小板濃度為(600～700)×109個/L，按照比濁法，應用血小板聚集儀，貧血小板血漿調零后，在攪拌情況下，加入血小板誘導劑ADP，測定血小板最大聚集率，并計算各組的血小板聚集抑制率，血小板聚集抑制率=(正常組聚集率－給藥組聚集率)×100%/正常組聚集率。

1.4.2 大鼠動－靜脈旁路血栓 SD大鼠40只隨機分為5組。各組末次給藥2 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠(30 mg/kg)，仰臥位固定。分離右頸總動脈和左頸外靜脈，用肝素鈉生理鹽水溶液(50 U/ml)灌注聚乙烯插管，聚乙烯插管(內置手術線，長6 cm)一段插入左頸外靜脈，另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，開放血流并記錄時間，血流從動脈流經聚乙烯管回到靜脈，等15 min血栓形成后阻斷血流，迅速取出手術線，稱量血栓濕重(總重量減去手術線重量即為濕重)，血栓在室溫下干燥后測量干重。

1.4.3 小鼠血常規、出血和凝血時間 昆明種小鼠50只隨機分為5組，實驗前12 h禁食不禁水。各組末次給藥2 h后，將小鼠尾尖部剪斷5 mm并將尾巴放入含有10 ml生理鹽水的試管中(37℃水浴保溫)，保持尾尖端在液面下1.5 cm，記錄停止出血時間，小鼠腹主動脈抽血300 ml測定血常規，拔出針頭，使血液自動流出，用棉球輕輕拭去第一滴血，再分別滴血于清潔載玻片的兩端，血滴直徑為0.5～1.0 cm，開始用秒表計時，2 min后，每隔30 s用潔凈的注射劑針頭自血滴邊緣向里輕輕挑動1次，到針頭能挑起纖維白絲為止，記錄所需時間，即為凝血時間。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件進行分析，實驗數據以±s表示。組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s C檢驗。

2 結果

2.1 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對大鼠血小板聚集的影響 各組連續7 d給藥后能夠明顯降低大鼠最大血小板聚集率(P＜0.01);小劑量氯吡格雷抗血小板聚集活性明顯強于丹皮酚組(P＜0.05)，聯合給藥組抑制大鼠血小板聚集作用明顯強于氯吡格雷常規劑量組(6 mg/kg)和丹皮酚組(P＜0.05，P ＜0.01)。見圖1A。

2.2 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對大鼠動－靜脈旁路血栓形成影響 與正常組比較，各給藥組能明顯減少大鼠血栓濕重和干重(P＜0.01);小劑量氯吡格雷組對血栓形成的抑制能力明顯強于丹皮酚組(P＜0.05)，聯合給藥組抗血栓作用明顯強于氯吡格雷小劑量組(3 mg/kg)、氯吡格雷常規劑量組(6 mg/kg)和丹皮酚組(P ＜0.05，P ＜0.01)，見圖1B、表1。

圖1 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對大鼠血小板聚集影響 (n=8，±s)

2.3 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對小鼠出血、凝血時間和血常規影響 各給藥組均能明顯延長小鼠出血時間(P＜0.01)，但對凝血時間沒有明顯影響;小劑量氯吡格雷(4.5 mg/kg)組出血時間明顯長于丹皮酚組(P＜0.01)，聯合給藥組延長出血時間作用明顯強于氯吡格雷(9 mg/kg)組和丹皮酚組(P ＜0.05，P ＜0.01);此外，和其他各組相似，聯合給藥組對小鼠血常規無明顯影響，提示聯合給藥對小鼠血液系統影響較小，安全性較高。見表2。

表1 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對大鼠動－靜脈旁路血栓形成影響(n=8，±s)

表1 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對大鼠動－靜脈旁路血栓形成影響(n=8，±s)

與正常組比較:＊＊P＜0.01;與氯吡格雷(3 mg/kg)組比較:★★P＜0.01;與氯吡格雷(6 mg/kg)組比較:#P＜0.05;與丹皮酚組比較:△P＜0.05，△△P ＜0.01

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表2 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對小鼠出血、凝血時間和血常規影響(n=10，±s)

表2 小劑量氯吡格雷聯合丹皮酚給藥對小鼠出血、凝血時間和血常規影響(n=10，±s)

與正常組比較:＊＊P＜0.01;與氯吡格雷(9 mg/kg)組比較:#P＜0.05;與丹皮酚組比較:△△P＜0.01

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3 討論

氯吡格雷屬于前體藥物，在腸道吸收后，約有85%被肝臟羧酸酯酶［9］轉化成無活性代謝物，剩下15%借助肝藥酶CYP1A2、CYP2C19和 CYP2B6代謝成中間體2-氧化-氯吡格雷，該中間體被CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4和 CYP3A5等酶代謝成活性代謝物R-130964。R-130964可抑制血小板ADP受體與ADP結合，阻止ADP介導纖維蛋白原與糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體結合，從而抑制血小板相互聚集。

目前氯吡格雷已被廣泛用于心腦血管疾病的治療，但常規劑量［2］存在較為突出的消化道不良反應和明顯的抵抗現象［4］，主要表現在部分患者對藥物敏感性低甚至無反應。Prabhakaran et al［2］發現氯吡格雷標準劑量下給藥，患者發生抵抗比例高達51.9%，該現象與患者體內血小板聚集抑制率明顯低于正常反應者有關［10］。研究［3］顯示氯吡格雷抵抗現象除與肝藥酶編碼基因和ADP受體基因多態性、體內藥物相互作用以及胰島素抵抗等因素有關之外，還與其腸道吸收受P-糖蛋白干擾有關。Taubert et al［11］利用Caco-2細胞模型證實氯吡格雷是P-糖蛋白作用底物，隨后Lee et al［12］研究也發現P-糖蛋白抑制劑環孢素A與氯吡格雷聯合給藥明顯提高氯吡格雷在大鼠體內生物利用度，這些研究提示腸道上皮細胞吸收的氯吡格雷部分被P-糖蛋白重新外排至腸腔，造成原型藥進入肝臟代謝以及活性代謝物含量水平相應減少。

臨床研究［13］表明氯吡格雷負荷劑量從300 mg提高到600 mg可提高患者血漿中活性代謝物含量，部分改善抵抗現象，但當劑量增至900 mg時，體內活性代謝物含量以及抵抗現象與600 mg比較差異無顯著性，提示單純提高給藥劑量并不能很好改善抵抗現象。另外，目前臨床采用的氯吡格雷和阿司匹林聯合給藥雖然可以短期內提高療效，但存在消化道不良反應發生頻率升高危險。研究［14］顯示阿司匹林長期應用可誘導多藥耐藥基因MDR1表達并抑制氯吡格雷在腸道吸收。丹皮酚來源于中藥牡丹根皮，安全性高，具有抗血小板活性。已有研究［6，15］表明丹皮酚抗血小板聚集的作用機制與氯吡格雷不同。一方面，丹皮酚抗血小板聚集活性與阻斷血小板膜上Ca2+通道，抑制Ca2+內流并降低血小板內Ca2+濃度水平有關;另一方面，丹皮酚抑制花生四烯酸代謝，降低血栓素A2含量，是其抗血小板聚集活性重要機制之一。此外，丹皮酚還可抑制P-糖蛋白活性［7］。因此該研究初步考察小劑量氯吡格雷和丹皮酚的協同效應。氯吡格雷治療栓塞性心血管疾病臨床推薦劑量為(75 mg/d)，折算成大鼠和小鼠的等效劑量近似為6 mg/kg和9 mg/kg。該研究顯示丹皮酚抗血小板聚集活性弱于小劑量氯吡格雷，但兩者聯合給藥的抗血小板聚集活性卻明顯強于氯吡格雷常規劑量組，提示聯合給藥組強大的抗血小板聚集活性可能主要與丹皮酚抑制腸道P-糖蛋白表達，改變氯吡格雷在大鼠體內的吸收以及代謝過程有關，具體機制有待進一步研究闡明。

綜上所述，小劑量氯吡格雷和丹皮酚聯合給藥抗血小板聚集活性明顯強于氯吡格雷，兩者聯合給藥具有良好的臨床應用前景。

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