阿法替尼和吉非替尼分別聯合培美曲塞對人肺腺癌細胞作用的研究

邊 勁，王 琳，尋 琛，黃 偉

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)的臨床應用使晚期非小細胞肺癌的治療獲得了突破性進展。吉非替尼、厄羅替尼在臨床上已經廣泛應用，并且取得了很好的療效，但是長期治療幾乎所有患者均會產生耐藥。研究［1－2］顯示二代雙重不可逆性酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼(afatinib，BIBW2992)能夠克服肺癌治療中的獲得性耐藥。同時，目前關于EGFR-TKIs和化療藥物的聯合應用一直是研究的熱點。該實驗旨在探討BIBW2992、吉非替尼分別與培美曲塞聯合對吉非替尼敏感和耐藥型肺腺癌細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用，為臨床尋找克服第1代EGFR-TKIs耐藥制定方案提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺腺癌H1975細胞(EGFR基因外顯子20點突變，耐藥型)、PC-9細胞(EGFR基因外顯子19缺失，敏感型)由中國人民解放軍第八一醫院腫瘤中心實驗科提供;胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培養基、DMEM培養基均購自美國Thermo公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Amresco公司;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;吉非替尼和BIBW2992分別購自英國阿斯利康和德國勃林格殷格翰公司;培美曲塞購自美國禮來公司;內參(β-actin)、抗細胞胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)單克隆抗體一抗購自美國Zymed公司;鼠源二抗購自美國Cell Signaling公司;ECL化學發光試劑盒購自美國GE Healthcare公司;BCA試劑盒購自美國Pierce公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司。

1.2 細胞培養 PC-9、H1975細胞分別用含10%小牛血清的DMEM、RPMI-1640高糖培養液置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中常規培養。每1～3 d傳代1次。

1.3 MTT法檢測藥物對PC-9、H1975細胞生長作用影響 取生長良好的PC-9、H1975細胞制成1×108個/L細胞懸液，分別接種于96孔板中，每孔接種100 μl，每組設置6個復孔。細胞培養24 h貼壁生長后，再按實驗設計分別加入100 μl含有不同濃度 (0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞的培養基作用72 h，每孔加入MTT 20 μl，溫箱內孵育4 h棄上清液，加入100 μl鹽酸異丙醇，振蕩儀處理10 min后，用酶聯免疫檢測儀測定570 nm波長下各孔吸光值(A)，計算出各單藥作用72 h的半數抑制濃度(IC50)。以BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞分別在2種細胞中的IC50作為固定濃度單藥及聯合作用于PC-9、H1975細胞。實驗分組:① PBS對照組(C);② 吉非替尼單獨作用72 h組(G);③ BIBW2992單獨作用72 h組(B);④ 培美曲塞單獨作用72 h組(P);⑤吉非替尼聯合培美曲塞作用72 h組(G+P);⑥BIBW2992聯合培美曲塞作用72 h組(B+P)，實驗重復3次。細胞增殖抑制率(%)=1－(實驗組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測各組細胞周期分布及凋亡

取對數生長期細胞調整至1×108個/L，每孔2 ml，接種于6孔板，培養24 h后，以BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞分別在2種細胞中的IC50作為固定濃度單藥及聯合作用于PC-9、H1975細胞72 h后，收集細胞，在－20℃保存過夜。將固定的細胞離心棄上清液，PBS洗細胞2次，再次離心棄上清液加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，根據說明書加入Annexin V-FITC和PI染液，混勻、室溫、避光，反應10～15 min，用流式細胞儀測定PI熒光強度(激發波長480 nm，吸收波長630 nm)，檢測細胞周期分布，并計算凋亡百分比。

1.5 Western blot法檢測 BIBW2992、吉非替尼對細胞TS表達的影響 取對數生長期細胞調整至1×108個/L，每孔2 ml，接種于6孔板，培養24 h后，按實驗設計分組給藥后收集細胞，細胞裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，將蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素膜上，室溫下5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗(1∶800)搖床孵育過夜，TBST漂洗3次，每次約10 min，二抗(1∶2 000)37℃搖床孵育2 h，TBST漂洗3次，每次約10 min，電化學發光顯色系統顯色，曝光，顯影，凝膠分析系統分析蛋白的表達情況。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件分析，數據以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析，兩組之間互相比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 BIBW2992、吉非替尼單藥及分別與培美曲塞聯合對細胞增殖抑制作用 BIBW2992、吉非替尼單藥或分別聯合培美曲塞均能抑制PC-9、H1975細胞生長。BIBW2992和吉非替尼單藥作用72 h抑制PC-9細胞生長的IC50分別為5.81×10－10mol/L和4.54×10－8mol/L，BIBW2992和吉非替尼單藥作用72 h抑制H1975細胞生長的IC50分別為3.36×10－7mol/L 和1.18 ×10－5mol/L。分別取 BIBW2992、吉非替尼和培美曲塞在2種細胞中的IC50作為固定濃度研究兩藥聯合對PC-9和H1975細胞的生長抑制作用。結果顯示，在PC-9細胞中(B+P)、(G+P)組較之單藥組生長抑制作用均明顯增強，差異有統計學意義(P＜0.05)。在H1975細胞中僅(B+P)組對細胞生長抑制有協同增效作用，較單藥組明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 BIBW2992和吉非替尼單藥及分別與培美曲塞聯合對PC-9、H1975細胞周期的影響

2.2 BIBW2992吉非替尼單藥及分別與培美曲塞聯合對細胞凋亡及周期的影響 培美曲塞單藥作用于2種細胞時主要將細胞阻滯在 S期，分別為56.55%、55.98%。BIBW2992、吉非替尼單藥作用于2種細胞時大部分細胞主要被阻滯在G0/G1期，在PC-9細胞中分別為68.33%、64.12%，在 H1975細胞中分別為60.82%、63.77%。(B+P)、(G+P)組細胞雜亂的分布于各個周期見圖1。(B+P)、(G+P)組在PC-9細胞中較之單藥組均明顯提高了凋亡作用，差異有統計學意義(P＜0.05)。而在H1975細胞中，僅(B+P)組較單藥組誘導凋亡作用明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、圖2。

2.3 BIBW2992、吉非替尼對 PC-9、H1975 細胞 TS表達的影響 在PC-9細胞中BIBW2992和吉非替尼均可以顯著降低TS，而在H1975細胞中隨著藥物濃度逐漸增加BIBW2992仍顯著降低TS，而吉非替尼對TS表達無顯著抑制作用，見圖3。

表1 BIBW2992和吉非替尼分別與培美曲塞聯合對PC-9、H1975細胞生長抑制及凋亡作用(%，n=6，±s)

表1 BIBW2992和吉非替尼分別與培美曲塞聯合對PC-9、H1975細胞生長抑制及凋亡作用(%，n=6，±s)

與G+P組比較:＊＊P＜0.01;與 B+P組比較:##P ＜0.01

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3 討論

EGFR-TKIs是較早應用于臨床抗腫瘤的靶向藥物之一。絕大部分EGFR突變的非小細胞肺癌患者都對可逆性的第1代EGFR-TKIs敏感。但隨著治療時間的延長最終都會產生獲得性耐藥，如EGFR790位點上的蘇氨酸(threonjne)被甲硫氨酸(methlonlne)取代(T790M突變)造成近50%的腫瘤患者產生獲得性耐藥［3］，然而新的不可逆性雙重酪氨酸激酶抑制劑BIBW2992給患者帶來新的希望。BIBW2992不可逆的與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人表皮受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)酪氨酸激酶結合抑制其活性，進而阻斷EGFR-HER2介導的腫瘤細胞信號傳導途徑，從而抑制腫瘤細胞的增殖與轉移，誘導腫瘤細胞的凋亡。文獻［1－2］報道阿法替尼對既往接受過化療及EGFR-TKIs治療失敗的晚期非小細胞肺癌患者在治療上具有重要意義。文獻［4－5］報道在EGFR突變患者中一線應用BIBW2992與吉非替尼的效果相當，并且較之化療明顯延長了患者的無疾病進展生存期。

圖2 BIBW2992和吉非替尼分別與培美曲塞聯合對H1975細胞凋亡的影響

圖3 BIBW2992、吉非替尼對PC-9、H1975細胞TS表達的影響A:PC-9細胞;B:H1975細胞

研究［6］顯示BIBW2992雖然可以克服 T790M獲得性耐藥，但是敏感性較之突變敏感型細胞降低。該實驗中BIBW2992在 H1975細胞中的 IC50約為PC-9細胞的600倍，但仍然是臨床治療中可以達到的血藥濃度［7］，而吉非替尼在耐藥細胞 H1975中IC50約為PC-9細胞的300倍，在臨床治療中無法獲得。T790M突變不僅影響BIBW2992對肺腺癌細胞的生長抑制作用，同樣降低其他不可逆性EGFRTKIs(如CL-387、785和PF00299804)對肺腺癌細胞的敏感性［8－9］。因而新型靶向藥物在臨床應用對于獲得性耐藥患者盡管有效，但是療效可能會受到一定的限制。目前關于EGFR-TKIs聯合化療已經逐漸成為研究的熱點。研究［10］顯示的一項多中心開放Ⅱ期臨床研究表明培美曲塞同步聯合厄洛替尼能提高晚期肺癌患者的中位無疾病進展時間和中位總生存時間。Yoshimura et al［11］研究中也發現 EGFRTKIs治療耐藥后運用培美曲塞序貫聯合吉非替尼方案患者仍可以明顯獲益。這提示可以將EGFRTKIs與培美曲塞聯合以期達到協同增效作用從而更好的克服EGFR-TKIs耐藥。因而本實驗同時將吉非替尼、BIBW2992分別與培美曲塞聯合作用于PC-9、H1975細胞，探討二者是否存在協同增效作用。

實驗結果提示BIBW2992與培美曲塞聯合對PC-9、H1975細胞的增殖抑制和誘導凋亡均存在協同增效作用，而吉非替尼與培美曲塞聯合僅在PC-9細胞中起到協同增效作用，這與Takezawa et al［6］研究結果基本一致。通過觀察細胞周期結果發現，培美曲塞主要將細胞阻滯在S期，而BIBW2992和吉非替尼均將細胞主要阻滯在G0/G1期，二者聯合將細胞雜亂阻滯在各周期，從細胞周期角度無法解釋兩藥聯合增效的機制。

研究［12］顯示吉非替尼和另一種針對TS靶點的藥物S-1聯合無論在野生型還是突變型細胞中均可以起到協同抗腫瘤作用，主要由于吉非替尼降低TS從而增強S-1對肺腺癌細胞的抑制作用有關。而在T790M突變的肺腺癌細胞中，吉非替尼無法顯著降低TS，因而無法起到協同增效作用［13］。但有研究［6］顯示在吉非替尼耐藥的肺腺癌細胞系中，BIBW2992仍可以明顯降低EGFR磷酸化以及下調TS蛋白水平。本實驗將不同濃度的BIBW2992和吉非替尼分別作用于 PC-9、H1975細胞后發現，BIBW2992和吉非替尼均可以顯著下調PC-9細胞TS，而在H1975細胞中，BIBW2992仍然可以顯著降低TS，而吉非替尼下調TS作用不明顯。這可能是BIBW2992與培美曲塞聯合在吉非替尼耐藥細胞中仍然可以起到協同增效作用的主要機制。

本實驗顯示BIBW2992不僅可以克服吉非替尼耐藥，且與針對TS靶點的藥物培美曲塞聯用時可以對耐藥細胞H1975具有協同增效作用。但是本實驗僅僅選擇了一種T790M突變耐藥細胞，一種突變敏感型細胞，因而還有待于在更多不同類型肺腺癌細胞以及與其他TS靶點藥物(如S-1、5-FU)聯合加以證實，同時有待于在體內進行實驗以期更好的指導臨床方案的選擇。目前，已經有研究［14］表明除了T790M突變產生的獲得性耐藥，HER2基因擴增在EGFR-TKIs以及西妥昔單抗的獲得性耐藥中同樣存在重要作用，而由于BIBW2992的雙靶點作用，BIBW2992將在未來克服針對EGFR靶向藥物的獲得性耐藥治療中具有更加重大的意義。

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