天麻素預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的可能機制

位 凱，王 飛，張 瑾，李 珍，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金蘭

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)其病理機制主要與氧自由基過多、鈣超載、炎癥反應、細胞凋亡等有關［1］。天麻是一種具有多種功效的中藥，天麻素(4-羥甲基苯甲醇-β-D吡喃葡萄糖甙)是其活性最高的有效單體，具有改善神經系統血供、鎮靜、催眠和抗驚厥的作用［2］，還具有降低外周血管阻力和血壓的作用［3－4］。該課題組前期研究［5］顯示天麻素預處理能明顯減輕大鼠MIRI，可能與減輕MIRI時的炎癥細胞浸潤有關，在炎癥反應中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)起主要作用，因此該實驗在原有實驗的基礎上，從炎癥因子變化的角度進一步探討天麻素預處理減輕大鼠MIRI作用的可能機制。前期研究［5］還表明天麻素可能會抑制Ca2+超載，這種作用是否與肌漿網Ca2+－ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+－ATPase，SERCA)有關，也是本研究要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 60只健康成年SPF級SD大鼠(安徽省實驗動物中心)，雌雄不拘，體重(230±10)g，隨機分為假手術組，MIRI組，0.1、0.2 和0.4 g/kg天麻素組。

1.2 主要試劑及儀器 天麻素(批號:2010081，純度:99.2%，江蘇寶澤堂醫藥科技有限公司);TNF-α、IL-6、SERCA檢測試劑盒(上海森雄科技實業有限公司);其他試劑均為分析純;BL-420E生物信號采集分析系統、動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司);SpectraMax190酶標儀(Molecular Devices公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠MIRI模型制備 于每日上午9∶00對各組大鼠灌胃給藥:假手術組與MIRI組均給予生理鹽水灌胃，天麻素組分別給予0.1、0.2和0.4 g/kg的天麻素灌胃，連續7 d。于第7天灌胃后建立大鼠MIRI模型:用10%水合氯醛以3 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉，做氣管插管，連接呼吸機(呼吸頻率60次/min，潮氣量11 ml/次，呼 －吸之比為1∶2)。四肢皮下連接電極，標Ⅱ導聯接BL-420E生物信號采集分析系統連續記錄心電圖。在左側第3～4肋間隙之間鈍性分離肌肉，暴露心臟，在左心耳下緣處以冠狀靜脈主干為標志，用5-0號帶針無創縫合線進針，向肺動脈圓錐方向出針，連同直徑2 mm塑料管一起打活結結扎左冠狀動脈前降支，缺血成功的標志為Ⅱ導聯R波增寬，ST段抬高，缺血30 min后，松開結扎線，再灌注2 h，再灌注成功的標志為抬高的ST段下降，S波幅值恢復50%以上。假手術組術中只穿線，不結扎左冠狀動脈前降支。

1.3.2 血清及心肌組織檢測 各組于缺血再灌注2 h后分別從腹主動脈取血約4 ml，以3 500 r/min離心10 min，得到大鼠血清，分裝，－20℃冰箱儲存;并取各組結扎線下方左心室前壁心肌組織，切取一部分心肌組織于－80℃冰箱儲存，剩余部分置于4%福爾馬林溶液中固定，將用于形態學實驗。按試劑盒說明書檢測血清及心肌組織中TNF-α、IL-6和SERCA水平，用酶標儀測各組吸光度值。

1.3.3 心肌組織形態學檢測 取左心室前壁心肌組織進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態學的變化。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據以±s表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 天麻素預處理對血清及心肌組織中TNF-α的影響 與假手術組相比，MIRI組血清及心肌組織中TNF-α含量均明顯增高，差異有統計學意義 (P＜0.01)，說明MIRI時 TNF-α參與其中。與MIRI組相比，0.1 g/kg天麻素組血清及心肌組織的TNF-α含量略減少，差異無統計學意義(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組血清及心肌組織的TNF-α含量均減少，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明天麻素預處理可以減輕心肌缺血再灌注時TNF-α的釋放;不同濃度天麻素組兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，表明其作用無劑量依賴性，見表1。

表1 各組大鼠血清及心肌組織中TNF-α含量比較(n=12，±s)

表1 各組大鼠血清及心肌組織中TNF-α含量比較(n=12，±s)

與假手術組比較:＊＊P ＜0.01;與 MIRI組比較:##P ＜0.01

?

2.2 天麻素預處理對血清及心肌組織中IL-6的影響 與假手術組相比較，MIRI組血清及心肌組織中的IL-6含量均明顯增高，差異有統計學意義 (P＜0.01)，說明MIRI時IL-6參與其中。與MIRI組相比，0.1 g/kg天麻素組血清及心肌組織的IL-6含量略減少，差異無統計學意義(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組血清的IL-6含量減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，心肌組織中的IL-6含量亦減少，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明天麻素預處理可以減輕心肌缺血再灌注時IL-6的釋放;不同濃度天麻素組兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，表明其作用無劑量依賴性，見表2。

表2 各組大鼠血清及心肌組織中IL-6含量比較(n=12，±s)

表2 各組大鼠血清及心肌組織中IL-6含量比較(n=12，±s)

與假手術組比較:＊＊P＜0.01;與MIRI組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

?

2.3 天麻素預處理對心肌組織中SERCA的影響

與假手術組相比較，MIRI組心肌組織中的SERCA含量明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明MIRI時心肌組織中SERCA含量減少。與MIRI組相比，0.1 g/kg天麻素組心肌組織中的SERCA含量略增高，差異無統計學意義(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素組心肌組織中的SERCA含量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明天麻素預處理可以增加心肌缺血再灌注時SERCA的含量;不同濃度天麻素組兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，表明其作用無劑量依賴性，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中SERCA含量比較(n=12，±s)

表3 各組大鼠心肌組織中SERCA含量比較(n=12，±s)

與假手術組比較:＊＊P＜0.01;與MIRI組比較:##P＜0.01

?

2.4 天麻素預處理對心肌組織形態學的影響 各組心肌組織經HE染色后可見:假手術組心肌細胞排列整齊，胞膜完整，界限清晰，胞質、胞核著色均勻，見圖1A;MIRI組心肌細胞排列不整齊，界限不清，有明顯水腫，毛細血管擴張，可見紅細胞、炎癥細胞浸潤，見圖1B，這從形態學上進一步證明模型制備成功;0.1 g/kg天麻素組排列不整齊，界限不清，水腫較明顯，毛細血管擴張，可見紅細胞、炎癥細胞浸潤，見圖1C;而0.2、0.4 g/kg天麻素組心肌細胞排列較整齊，橫紋較清晰，界限較清楚，無明顯水腫，僅有少量紅細胞、炎癥細胞浸潤，見圖1D、E。從形態學上進一步證明天麻素預處理后可以減輕MIRI時的炎細胞浸潤。

3 討論

MIRI是心肌在缺血的基礎上恢復血流后，組織器官的損傷反而加重的現象，是一個復雜的病理生理過程，其中炎癥反應貫穿于心肌細胞損傷的全過程［6］。本課題組前期研究［5］顯示天麻素預處理后能減輕MIRI時心肌組織間隙炎癥細胞的浸潤，說明天麻素能抑制炎細胞浸潤，在炎癥反應中TNF-α和IL-6起到主要作用，那么天麻素是否通過影響TNF-α和IL-6來實現抑制炎細胞浸潤?因此，本實驗通過觀察大鼠血清及心肌組織中炎性因子TNF-α、IL-6的含量變化來進一步研究天麻素預處理對MIRI的作用。

TNF-α是一種重要的細胞炎癥因子，心肌是其作用的靶器官［7］，通過多種機制參與MIRI過程，不僅可以激活細胞因子級聯反應，而且還可以促進氧自由基的產生、活化中性粒細胞、誘導心肌細胞凋亡，加重心肌損傷［8］。IL-6被稱為白介素家族的核心成員，具有廣泛的生物學效應［9］，參與炎癥反應的調節，可以誘導中性粒細胞內流入缺血的心肌組織，刺激中性粒細胞、心肌細胞表面分別表達CD11b/CD18及細胞間黏附分子-1，介導與心肌細胞結合，損傷心肌［10］。這兩種細胞因子的水平與缺血再灌注后的損傷程度有密切關聯。本研究顯示MIRI組的血清及心肌組織中炎癥因子TNF-α和IL-6含量明顯高于假手術組，這說明 TNF-α和IL-6均參與了缺血再灌注損傷時的炎癥反應，而0.2、0.4 g/kg天麻素組與MIRI組相比，TNF-α和IL-6含量顯著降低，說明天麻素預處理能減輕缺血再灌注損傷時炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。同時形態學表明，缺血再灌注時炎癥細胞浸潤明顯，而0.2、0.4 g/kg天麻素預處理后炎細胞浸潤明顯減輕，亦從形態學角度再次證明了上述觀點。以上結果提示天麻素預處理后能通過減少缺血再灌注時炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，從而抑制炎癥因子引起的中性粒細胞遷移浸潤，減輕炎癥損傷的惡性循環，對心肌細胞起到保護作用。

Ca2+作為第二信使在心肌興奮收縮耦聯中起關鍵作用。肌漿網中的SERCA負責調控肌漿網對Ca2+的攝取，將心肌細胞胞漿中的Ca2+攝回肌漿網中。缺血再灌注后，由于細胞內環境的改變，導致細胞內酸中毒，從而抑制SERCA的活性，降低肌漿網攝鈣的能力，久之細胞內就會發生鈣超載，加重心肌損傷［11］。本研究顯示0.2、0.4 g/kg天麻素預處理后心肌組織中的SERCA含量增加，提示天麻素能夠增加缺血再灌注損傷時心肌組織中的SERCA的含量，從而增加對肌漿網Ca2+的攝取，減輕細胞內鈣超載，對心肌細胞起到一定的保護作用。因此天麻素抑制Ca2+超載可能與其增加SERCA含量有關。

綜上所述，本實驗進一步證明天麻素預處理能夠減輕MIRI，其機制可能與減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，增加SERCA的含量有關。

［1］唐麗敏，賀永貴，張義東，等.心肌缺血/再灌注損傷發生機制及其保護研究進展［J］.中國煤炭工業醫學雜志，2013，16(1):159－63.

［2］孫中吉，王 輝.天麻素注射液的藥理作用和臨床應用［J］.時珍國醫國藥，2008，19(4):1011 －3.

［3］黃麗亞.天麻素注射液上調抗氧化酶表達作用的實驗研究［J］.陜西中醫藥雜志，2006，27(2):242 －3.

［4］王正榮，羅紅淋，肖 靜，等.天麻素對動脈血管順應性以及學流動力學的影響［J］.生物醫學工程雜志，1994，11(3):197－201.

［5］王 飛，位 凱，沈 兵，等.天麻素預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中國藥學雜志，2012，47(23):1905－10.

［6］Yellon D M，Hausenloy D J.Myocardial reperfusion injury［J］.N Engl J Med，2007，357(11):1121 －35.

［7］張步升，張郁林.腫瘤壞死因子-α在心肌缺血再灌注損傷中的作用［J］.實用臨床醫藥雜志，2009，13(4):115 －7.

［8］劉 晟，蔡 晨，唐益中，等.葛根素對燙傷大鼠心肌損害的保護作用［J］.安徽醫科大學學報，2005，40(5):426 －8.

［9］唐婷婷.實驗性矽肺大鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞和白介素6的變化及意義［J］.安徽醫藥，2012，16(7):894 －6.

［10］Gwechenberge M，Mendoxa L H，Youker K A，et al.Cardiac myocytes produce interleukin-6 in culture and in viable border zone of reperfused infarctions［J］.Circulation，1999，99(4):546 －51.

［11］蔣艷偉，鄭 娜，劉秀娟，等.大鼠心肌缺血后SERCA和PLB基因表達變化的觀察［J］.中國法醫學雜志，2008，23(4):231－4.