HCMV重組嵌合抗原表達質粒構建及免疫反應的初步鑒定

曾憲聰，汪小五，陳 偉，王林定，2

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)又稱為人皰疹病毒5型，屬β-皰疹病毒亞科，HCMV感染極為普遍，在育齡期婦女中感染率可達95%以上［1－2］。此外，HCMV感染可通過胎盤侵襲胎兒引起先天性感染，少數造成早產、死產或生后死亡［3］。母嬰感染HCMV的快速診斷對于決定是否保留胎兒，及采取何種干預措施非常重要。目前國內外已有多家實驗室及試劑生產廠家研制生產HCMV IgM抗體檢測試劑盒，由于缺乏靈敏度強和特異性高的抗原以及生產條件和標準各異［4］，因此該實驗進一步研究HCMV相關基因為實驗室診斷與應用提供支持，提高我國孕婦早期HCMV感染的檢出率。

1 材料與方法

1.1 材料來源 pQE-80L、菌株BL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ購自日本TaKaRa公司;PVDF膜購自上海生物工程有限公司;Ni2+-NTA親和層析柱購自美國GE公司;50 ml親和層析預裝柱購自上海生物工程有限公司;HRP標記山羊抗人IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司;ECL化學發光試劑盒購自瑞士Thermo公司。

1.3 重組表達質粒的構建

1.3.1 HCMV抗原片段引物設計 利用Protean軟件分析了 UL32［5－6］、UL44［7］、UL83［8－9］、氨基酸序列，抗原性強且親水性好的片段。分析了 UL32、UL44、UL83氨基酸序列。選擇 UL32A(372aa～442aa，213 bp)UL32B(522aa ～ 552aa，93 bp)、UL32C(705aa～727aa，69 bp);UL44選擇2個片段，分別為 UL44A(1aa ～40aa，120 bp、)UL44B(403aa～421aa，57 bp);UL83選擇 3個片段，分別為UL83A(169aa ～ 271aa，309 bp)、UL83B(361aa ～478aa，354 bp)、UL83C(535aa ～ 561aa，81 bp)。選取在蛋白質N端和C端之間的區域，Jameson-wolf抗原決定簇選正分高處;Kyte-Doolittle預測親水性強的區域。最后將選擇好的氨基酸序列連成一條完整序列，預測重組蛋白在大腸桿菌中表達的可溶性。預測網址:http://biotech.ou.edu/。然后根據選定基因段序列，設計合理引物。各基因的片段用Overlap PCR方法連接，引入 PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ酶切位點，Overlap PCR引物設計，在引物A2的3'端加入了B基因5'端的序列，在引物B1的5'端加入了20個A基因3'端序列。由于需要構建到pQE-80L的質粒中，故在每個融合基因的兩端加入酶切位點，在引物B2的3'端加入BamHⅠ的酶切位點，引物A1的5'端加入BglⅡ與SalⅠ酶切位點，便于引入新的基因片段。見表1。

1.3.2 含目的基因的克隆載體和表達載體的構建PCR產物膠回收，按DNA回收試劑盒說明進行操作。回收的PCR產物與pQE-80L載體進行雙酶切，酶切后的產物轉化至Top10感受態細胞，挑取過夜培養的單菌落，接種于5 ml含Amp的LB培養基的試管中，37℃培養過夜，提取質粒，(按質粒提取試劑盒的說明書操作)。質粒經PCR(PCR反應體系:94℃變性3 min;94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 1 min;循環35次，72℃延伸10 min)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物和酶切產物。質粒和酶切產物送至上海生物工程有限公司進行序列測定。

表1 重組質粒引物

1.3.3 重組質粒 pQE-80L-UL32-UL44-UL83轉化將pQE80-L重組質粒轉化入BL21(DE3)中，冰浴30 min，42℃水浴中熱擊60 s，冰浴5 min。加入600 μl LB培養基，于37℃、200 r/min搖床培養45 min后，離心后將菌液均勻涂布在含Amp抗生素的LB固體培養基上，37℃ 倒置培養過夜。

1.3.4 目的蛋白的誘導、表達與純化 挑取轉化了含有目的片段的pQE-80L重組質粒的BL21(DE3)單菌落，接種到3 ml含Amp的LB液體培養基中，37℃恒溫搖床200 r/min培養過夜后，按1∶50轉種2～4 h(OD600達0.5左右)取1 ml做誘導前對照，按1∶1 000加入誘導劑(IPTG)終濃度為1 mmol/L，次日取5 ml復蘇后的菌液轉種到500 ml含Amp的LB液體培養基中，37℃搖床培養過夜。樣品加入終濃度1 mmol/L的IPTG。培養6、8 h各取1 ml培養物作為誘導后樣品4 000 r/min離心10 min收集剩余菌體。兩次取樣用于SDS-PAGE電泳分析誘導情況。

含重組菌的LB培養液(500 ml)7 000 r/min離心30 min用裂解緩沖液(非變性)懸浮沉淀的菌體。加入終濃度為1 mg/ml溶菌酶及終濃度為1 mmol/ml蛋白酶抑制劑PMSF，冰上放置30 min。超聲波破碎儀破碎菌體8 000 r/min離心30 min，過濾收集上清液即為上清粗蛋白(目的為防止有雜質堵住柱頭避免柱流速度過慢)。沉淀加含8 mol/L尿素的變性裂解緩沖液50 ml室溫溶解8 000 r/min離心30 min后取上清液過濾后即為包涵體粗蛋白。分別取少量上清液和包涵體樣品電泳確定目的蛋白的表達部位。

Ni-NTA填料的預處理:用10倍柱體積的ddH2O清洗Ni2+親和層析柱，用10倍的裂解緩沖液平衡柱子后，將已預處理好的Ni-NTA懸浮液混勻填裝柱子，柱體積達到約1.5 ml。將上清液或包涵體蛋白質樣品反復上柱2～3次。依次用5倍柱體積的裂解緩沖液(pH 8.0);5倍柱體積的洗滌緩沖液(pH 6.3)過柱，洗脫雜蛋白;用 5倍柱體積的洗脫緩沖液(pH 5.9)將吸附在Ni柱中的目的蛋白洗脫，控制流速0.5 ml/min左右分管收集洗脫樣品。純化蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3.5 Western blot法檢測目的蛋白免疫原性 蛋白樣品，經SDS-PAGE分離后轉移至 PVDF膜上，Western blot按照(分子克隆)所述方法，所用一抗(1∶100)為HCMV確診患者陽性血清和普通人群正常血清各一份。而二抗HRP標記山羊抗人IgG抗體(1∶15 000)加入化學發光劑，曝光，拍照。

2 結果

2.1 重組融合抗原表達質粒PCR鑒定 獲得的重組質粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83，經 PCR擴增鑒定，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳擴增出約1 356 bp大小的相應基因片段。證明該融合抗原表達質粒均已構建成功，送樣至上海生物工程有限公司進行序列測定，序列比對正確。見圖1A。

2.2 重組融合抗原表達質粒酶切鑒定 挑取重組質粒 pQE80-L-UL32-UL44-UL83，用 BamHⅠ，SalⅠ做雙酶切后經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，電泳出現1 356 bp大小的條帶，證明PQE-80L表達載體質粒構建成功。酶切有目的條帶的重組質粒送上海生物工程有限公公司進行測序，測序結果正確。見圖1B。

2.3 HCMV重組融合抗原蛋白誘導表達與純化將HCMV重組融合抗原質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)受體菌中，ITPG誘導后，重組蛋白成功表達

圖1 pQE80-L-UL32-UL44-UL8目的基因PCR擴增和重組質粒雙酶切鑒定A:HCMV重組融合抗原表達質粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83質粒酶切電泳圖;B:HCMV重組融合抗原表達質粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83 PCR產物電泳圖;M:Marker;1:重組 pQE80-L-UL32-UL44-UL83質粒雙酶切;2:PCR產物

于大腸桿菌中，并經SDS-PAGE電泳分析誘導情況，電泳顯示重組蛋白以包涵體形式表達。包涵體粗蛋白經過Ni親和層析純化，見圖2，含pQE80-L-UL32-UL44-UL83/BL21(DE3)表達含大小約為52 ku的蛋白，SDS-PAGE電泳6～7泳道顯示約在50 ku處有條帶，與預期目的蛋白大小相一致;但在約70 ku的位置也出現了一條帶，考慮其為蛋白特異性條帶。

圖2 HCMV重組嵌合抗原蛋白pQE80-L-UL32-UL44-UL83/BL21(DE3)的誘導表達與純化M:Marker;1:重組菌誘導前;2～3:重組菌誘導后6、8 h;4:重組菌破碎后上清液;5:重組菌破碎后包涵體;6～7:重組菌體Ni2+-NTA柱純化

2.4 Western blot法鑒定免疫反應性 純化了的目的蛋白經SDS-PAGE電泳之后，轉至硝酸纖維素膜上，進行Western blot鑒定，誘導前后與純化后的結果。見圖3。通過ELISA篩查出陽性和陰性血清各一份作為一抗;誘導的菌體蛋白中沒有和HCMV陽性血清反應的條帶，但是有一些非特異性的條帶，發現在誘導后和目的蛋白純化后的樣品在預期分子量處出現了特異性的條帶，這和上圖誘導純化后條帶相符，而且反應性很強。初步證實此重組融合抗原是HCMV的特異性抗原;具有免疫反應性。

圖3 Western blot法分析重組融合抗原蛋白pQE80-L-UL32-UL44-UL83A:HCMV陽性血清反應;B:HCMV陰性血清反應;M:Marker;1:誘導前樣品;2:誘導后樣品;3:Ni2+-NTA純化后蛋白樣品Western blot HCMV+是與陽性血清作為一抗有反應，HCMV－是與陰性血清作為一抗均沒有反應

3 討論

本實驗分析了 HCMV UL32、UL44、UL83蛋白抗原性強且親水性高的氨基酸片段，分別編碼抗原p150、p52、pp65 具有很好的抗原性;有文獻［10－11］報道多種巨細胞病毒抗原組合可以獲得比單一重組抗原更好的結果，國內方毅 等［11］報道用重組嵌合抗原gp52和PP150的抗原性做了檢測分析，陽性率也達到了 92%。國內孫鵬 等［12］報道了 p150、p52、pp65的靈敏度/特異性分別是70%/100%、80%/100%、73.3%/100%，Landini et al［13］對 UL44、UL80a單一片段的重組抗原和多功能重組抗原做了比較，證明多種巨細胞抗原重組陽性檢出率(98%)明顯高于單片段重組抗原陽檢率(72%)。從結果可知重組單片段優勢抗原可以克服全病毒假陽性反應，但是陽性檢出率較低;用重組巨細胞病毒融合抗原可獲得比單一片段重組抗原更好的結果。綜上文獻報道都充分證實了選用多個基因片段構建的重組嵌合抗原檢測HCMV可以大大提高感染檢出率，檢測早期活動性的感染，其實際價值遠遠大于單片段的檢測［13］。因此筆者通過將HCMV各基因相應氨基酸序列相融合，通過與pQE80-L質粒連接，構建重組表達質粒，再通過不斷酶切連接的方法，成功構建HCMV重組融合抗原表達質粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83;其酶切后大小如圖1所示為1 356 bp，且序列測序比對正確。重組質粒導入大腸桿菌BL21(DE3)后，可成功表達，經SDS-PAGE分離及Western blot驗證，確證其為目的蛋白。重組菌在經終濃度為1 mmol/L IPTG成功誘導6～8 h后，收集并破碎菌體，經確認其表達是在包涵體中。通過Ni2+-NTA進行初步純化，含His-Tag的蛋白可被洗脫。但由于重組融合抗原蛋白較大，容易出現比目的蛋白較大的條帶;如圖2結果顯示在分子量(Marker)50 ku處有目的條帶出現，但是約在70 ku顯示有一條條帶，在圖3的Western blot鑒定中得到證實考慮為重組融合抗原的特異性條帶;與血清結合反應也證實了該重組嵌合抗原其具有很好免疫反應性和特異性。

由于HCMV目前診斷沒有統一的標準及其標準的診斷試劑盒。有報道［14］表明間接ELISA的抗HCMV-IgM陰性并不能排除HCMV感染的可能性。設計這種重組質粒，可以在后續試驗中進行比較重組蛋白的特異性及靈敏度。提高孕婦HCMV早期感染檢出率;提高優生優育，及其他相關疾病的發生;開發HCMV早期診斷的快速、靈敏的診斷試劑盒，就顯得更有意義。

［1］饒美蘭，鄭 瑛，張暢斌.孕婦巨細胞病毒感染及其母嬰垂直傳播［J］.中國生育健康雜志，2008，19(2):95 －8.

［2］Odeberg J，Wolmer N，Falci S，et al.Late human cytomegalovirus(HCMV)proteins inhibit differentiation of human neural precursor cells into astrocytes［J］.J Neurosci Res，2007，85(3):583 －93.

［3］Neirukh T，Qaisi A，Saleh N，et al.Seroprevalence of Cytomegalovirus among pregnant women and hospitalized children in Palestine［J］.BMC Infect Dis，2013，13(1):528.

［4］范行良，英志芳.人巨細胞病毒IgM抗體國家參考品的研制［J］.微生物學免疫學展，2012，40(3):30 －2.

［5］Sampaio K L，Cavignac Y，Stierhof Y D，et al.Human cytomegalovirus labeled with green fluorescent protein for live analysis of intracellular particle movements［J］.J Virol，2005，79(5):2754 －67.

［6］Ma Y，Gao S，Wang L，et al.Analysis and mapping of a 3＇coterminal transcription unit derived from humancytomegalovirus open reading frames UL30-UL32［J］.Virol J，2013，(10):65.

［7］Beqaj S H，Lerner A M，Fitzgerald J T，et al.Immunoassay with cytomegalovirus early antigens from gene products p52 and CM2(UL44 and UL57)detects active infection in patients with chronic fatigue syndrome［J］.J Clin Pathol，2008，61(5):623 －6.

［8］白 劍，肖 漓，石炳毅，等.器官移植術后人巨細胞病毒感染的實驗室診斷研究進展［J］.中國誤診學雜志，2008，8(12):2791－3.

［9］楊美芳，高海女，范 駿，等.pp65抗原血癥監測異基因造血干細胞移植受體CMV的感染［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2006，26(11):993.

［10］Bernard W，Annemarie B，Holger R，et al.Human cytomegalovirus infection:diagnostic potential of recombinant anigens for cytomegalovirus antibody detection［J］.J VirolMethods，2001，96(2):157－70.

［11］方 毅，司炳銀，祝慶余，等.巨細胞病毒ppl50和gp52融合基因的克隆表達及重組蛋白的抗原性研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2006，29(4):365 －6.

［12］孫 鵬，孫興寶，胡 鵬，等.重組人巨細胞病毒(HCMV)優勢表位嵌合抗原的構建表達以及捕獲法檢測IgM抗體［J］.遺傳，2007，29(11):1351 －6.

［13］Landini M P，Lazzarotto T，Maine G T，et al.Recombinantmono and polyantigens to detect cytomegalovirus specific immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassay［J］.J Clin Microbiol，1995，33(10):2535 －42.

［14］張新萍，李 沛.酶聯捕獲法檢測抗人巨細胞病毒-IgM抗體的實驗分析［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2003，17(3):285.