不同濃度的胎牛血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度及周期的影響

陳小丹，何家才

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是成熟體細(xì)胞的亞群，又稱為基質(zhì)干細(xì)胞，是治療中應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的基礎(chǔ)。MSCs具有黏附能力并且能夠在體外擴(kuò)增;多分化潛能:在特定的生理或是實(shí)驗(yàn)條件下能分化為特定的功能細(xì)胞、組織、器官，同時(shí)免疫抑制的能力［1］;這些特點(diǎn)使其成為組織工程再生醫(yī)學(xué)中理想的種子細(xì)胞［2］。然而BMSCs的含量極低，因此很難在短期內(nèi)獲得大量的BMSCs。分離擴(kuò)增大量的原始干細(xì)胞成為研究和應(yīng)用干細(xì)胞的先決條件。但其增殖和生長受很多因素影響，因此找到一個(gè)既簡單又可行的方法是在短期內(nèi)獲得大量BMSCs的重要問題。目前，體外培養(yǎng)BMSCs的完全培養(yǎng)液中大部分都加 FBS，而文獻(xiàn)［3－6］報(bào)道中關(guān)于BMSCs體外培養(yǎng)的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的濃度不盡一致。不同濃度的FBS對(duì)其生物學(xué)特性研究較少，該文探討3種不同濃度的FBS對(duì)BMSCs的純度及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠15只，4周齡，普通級(jí)，體重75～100 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 L－DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶(澳洲 Hyclone公司);熒光標(biāo)記抗大鼠CD29－PE、CD45－PE(美國 Biolegend 公司);CD44－FITC、CD90－FITC(美 國 Santa Cruz 公 司);Axiovert200倒置相差顯微鏡(德國Zelss公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);超凈工作臺(tái)(中國蘇州凈化公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司);CCK－8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(上海貝博生物試劑公司);細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離、培養(yǎng) 以頸椎脫臼法處死大鼠，置于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液中消毒5～7 min，在超凈臺(tái)中取出股骨和脛骨，然后放到另一杯乙醇溶液內(nèi)消毒5～6 s后用PBS洗3遍，再置于PBS內(nèi)。用注射器抽吸完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至股骨和脛骨兩端發(fā)白，然后按細(xì)胞濃度1×109/L將細(xì)胞懸液加入至培養(yǎng)瓶內(nèi)，隨后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后首次半量換液，以后每3 d全量換液1次，每次換液去除懸浮的雜細(xì)胞。

1.2.2 BMSCs的傳代培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞生長至80% ～90%融合時(shí)，用PBS洗細(xì)胞2～3次，然后加入胰蛋白酶1 ml消化 1.5～2.0 min，在鏡下見間隙增寬，細(xì)胞變圓，有少量細(xì)胞懸浮時(shí)立刻加含體積分?jǐn)?shù)為0.10 FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。然后制備成細(xì)胞懸液，離心，去上清液，以相應(yīng)的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后并按1×107/L傳代，記為第1代(P1)，以此類推第2、3、4、5 代記為 P2、P3、P4、P5。傳代時(shí)嚴(yán)格控制胰酶的時(shí)間，將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等去除。

1.2.3 BMSCs的鑒定 實(shí)驗(yàn)分為A、B、C 3組分別為用 0.10、0.15、0.20 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的 BMSCs，取A、B、C原代第72小時(shí)和第9天的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況并拍照記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測 BMSCs表面標(biāo)志 取A、B、C 3組原代細(xì)胞，2 d后首次半量換液，以后2～3 d全量換液1次，當(dāng)細(xì)胞長至80% ～90%融合時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代記為P1，然后依次傳代下去記為P2、P3、P4、P5。用PBS洗洗滌這3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的2、3、4、5 代細(xì)胞2 ～3 次，棄上清液，余 100 μl，配成終濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液。分別加入CD29－PE、CD45－PE(1.25 μl)，CD44－FITC、CD90－FITC(20 μl)，及同型對(duì)照，4 ℃避光孵育 30 min，之后再用PBS洗細(xì)胞2～3次，棄上清液，加入500 μl PBS，制備成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀，檢測PE、FITC標(biāo)記的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行表面抗原測定。

1.2.5 不同濃度的FBS對(duì)BMSCs細(xì)胞周期的影響取生長轉(zhuǎn)態(tài)良好的P3細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞2次，然后用0.25%的胰酶消化1.5～2.0 min，按細(xì)胞濃度為1.0×109/L傳代至12個(gè)一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每4瓶分為一組，隨機(jī)分為3組，3～5 h后細(xì)胞鐵貼壁，棄去原培養(yǎng)液，分別加入含體積分?jǐn)?shù)為0.10、0.15、0.20 的 FBS 的 L－DMEM 培養(yǎng)液，在 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，分別將相應(yīng)培養(yǎng)基孵育24、48、72、96 h的BMSCs用PBS洗洗滌細(xì)胞2～3次，70%乙醇固定過夜，次日PBS沖洗去乙醇，加入100 μl RnaseA，混勻，37 ℃水浴 30 min，然后加入 40 μl PI染液，4℃避光30 min，然后上機(jī)檢測相應(yīng)培養(yǎng)基孵育后的 24、48、72、96 h 的 BMSCs的周期。

1.2.6 不同濃度的FBS對(duì)BMSCs活力的影響 收集P3 BMSCs，調(diào)整細(xì)胞數(shù)制備細(xì)胞懸液，以密度為5×104/ml接種于6個(gè)96孔板中，每孔加FBS體積分?jǐn)?shù)是 0.10、0.15、0.20 的完全培養(yǎng)基制備的細(xì)胞懸液100 μl，置5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。于第1、2、3、4、5、6 天各取1 塊板，每孔加 10 μl CCK－8 溶液，37℃孵育3 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為450 nm時(shí)各孔的吸光度值(optical density，OD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差及t檢驗(yàn)分析多組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志 BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，單標(biāo)時(shí)CD29陽性率97.77%，CD90 陽 性 率 98.04%，CD44 陽 性 率99.38%，CD45陽率 1.96%;雙標(biāo)結(jié)果進(jìn)一步顯示BMSCs高表達(dá) CD29、CD90、CD44，低表達(dá) CD45，見圖1。取分別用含體積分?jǐn)?shù)為 0.10、0.15、0.20 3 種完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的P2～P5 BMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，A、B、C 3組細(xì)胞表面標(biāo)志物在P3、P4均能獲得較純的BMSCs，其表達(dá)率依次為:CD45平均表 達(dá) 率 為 4.29%、3.28%、1.80%;CD29 為93.23%、95.43%、93.94;CD44 為 91.27%，95.31%、94.92;CD90 為 95.55%、95.66%、95.05%，見表 1。

2.2 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng):用3種含不同體積分?jǐn)?shù)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs在剛接種到各自的培養(yǎng)瓶時(shí)，細(xì)胞呈大小不一的圓形，懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)。72 h后半量換液去除沒有貼壁的細(xì)胞，此時(shí)可見到多數(shù)細(xì)胞貼壁，呈圓形、類圓形，多角形，少數(shù)細(xì)胞伸展成長梭形，A、B、C 3組的貼壁細(xì)胞數(shù)依次增加，見圖2a、b、c。以后每2 d全量換液，不斷地去除雜細(xì)胞。到第9天時(shí)，細(xì)胞已鋪滿瓶底，呈現(xiàn)形態(tài)均一的長梭形，排列成漩渦狀，魚群狀，A、B、C 3組均已鋪滿瓶底，C組密度最大，其次B組，A組相對(duì) B、C 兩組較疏，見圖2d、e、f。

表1 3種不同濃度的胎牛血清中第2、3、4、5代BMSCs免疫表型流式檢測結(jié)果

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞(P3)表面標(biāo)志結(jié)果

圖2 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察圖 ×100a、b、c:A、B、C 3 組 BMSCs培養(yǎng)后 72 h;d、e、f:A、B、C 3 組 BMSCs第9天

2.3 流式細(xì)胞儀檢測BMSCs周期變化 表2顯示，3種完全培養(yǎng)基中的BMSCs的G0/G1期隨濃度的增加而降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同一濃度隨時(shí)間的延長也是降低;G2/M期在24 h后0.10與0.15組無差異，0.15 與 0.20 和 0.10 與 0.20 組有差異(F=12.412，P ＜0.05)，但隨時(shí)間的延長無差異。24、48、72、96 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn) S期的結(jié)果在3種完全培養(yǎng)基中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S+G2/M期在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨濃度的增加而增加。3種完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48、72、96 h 的 BMSCs的細(xì)胞周期見圖3。

2.4 隨著時(shí)間變化3種不同濃度培養(yǎng)基中的BMSCs的活力情況 在接種到96孔板的第1天A、B、C 3組的OD值依次增大，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，F(xiàn)=5.002)，隨著時(shí)間的延長三者的OD值無明顯差異，見圖4。

3 討論

MSCs存在于許多組織器官內(nèi)，首次是在骨髓內(nèi)被鑒定出來，主要特點(diǎn)是體外培養(yǎng)時(shí)具有黏附、自我更新能力，保持未分化特點(diǎn)，分化為成骨、成軟骨和脂肪細(xì)胞［7］，這是MSCs最基本的功能，此外還可以向管狀上皮細(xì)胞［8］，肝細(xì)胞等［9］分化，因具有以上功能因此被廣泛的應(yīng)用于組織工程、基因治療、細(xì)胞治療，被用來運(yùn)送生物制劑和檢測新植入材料的生物相容性。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測3種完全培養(yǎng)基中24、48、72、96 h的BMSCs的細(xì)胞周期

表2 細(xì)胞周期結(jié)果(n=4，%，±s)

表2 細(xì)胞周期結(jié)果(n=4，%，±s)

與體積分?jǐn)?shù)(0.20)比較:*P ＜0.05

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圖4 3種培養(yǎng)基中的BMSCs在培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6 d 的活力變化情況

目前分離BMSCs的方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠法、骨髓過濾裝置［10］，后3種方法易損傷細(xì)胞活性，過程繁雜，前2種方法培養(yǎng)的細(xì)胞在前2代有差別，但至P3均已無差異。因此該文選取簡單易行且能夠獲得足夠數(shù)量與純度的第一種方法。

至目前，對(duì)BMSCs的鑒定尚沒有統(tǒng)一的方案。一般是通過以下方法來鑒定:首先，黏附能力;其次:多分化潛能;最后:表面標(biāo)志，BMSCs無特異性表面標(biāo)志，因?qū)儆诜窃煅杉?xì)胞所以不表達(dá) CD11、CD14、CD34 和 CD45，高 表 達(dá) CD29［11］、CD44、CD73、CD271［12］、CD90、STRO－1 和 CD1 偶05/SH2。因?yàn)榭勾笫蟮目贵w非常少，因此本文選擇CD45－PE、CD29－PE、CD44－FITC、CD90－FITC 做為鑒定干細(xì)胞的標(biāo)志。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD45呈低表達(dá)而CD44、CD90、CD29高表達(dá)。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，P3細(xì)胞85%以上處于G0/G1期，說明是干細(xì)胞。

FBS含有BMSCs生長和增殖所需要的物質(zhì)如生長因子:TGF－β1、β3、FGF－2 等，因此都要在基礎(chǔ)培養(yǎng)液里加FBS［13］，但是關(guān)于適宜濃度，不同的文獻(xiàn)報(bào)道不盡一致。有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示11%FBS的完全培養(yǎng)基最適合BMSCs的增殖［3］，有的研究結(jié)果顯示 15%［4］、20%［5］的完全培養(yǎng)基中 BMSCs 顯示出最高的增殖能力，還有報(bào)道10% ～20%有利于BMSCs的增殖，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基是DMEM加10%的FBS。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)的結(jié)論一致，10%的完全培養(yǎng)基已經(jīng)適合BMSCs的體外擴(kuò)增培養(yǎng)。不同的結(jié)果也許是由于每1批次的FBS不同，槍頭準(zhǔn)確性，或是BMSCs培養(yǎng)傳代的過程中胰酶消化時(shí)間，傳代方法不同等原因，這些都會(huì)影響其相關(guān)特性和分化的能力，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行FBS批次的檢測。

細(xì)胞周期包括間期和分裂期2個(gè)階段，間期包括G0/G1期、S期、G2/M期，在此期間進(jìn)行著復(fù)雜的物質(zhì)合成和能量儲(chǔ)備。不同濃度FBS對(duì)BMSCs周期的影響是不同的，主要發(fā)生在間期內(nèi)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著時(shí)間的增加，3種完全培養(yǎng)基G0/G1期減少，S期+G2/M期減低，均能促進(jìn)BMSCs的增殖，3期中只有G2/M期在24 h時(shí)3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3組的G0/G1期、S期、G2/M期在其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

FBS內(nèi)含有營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，濃度的不同會(huì)影響B(tài)MSCs的增殖、分化、基因表達(dá)、穩(wěn)定性和活力。OD值可以間接反應(yīng)細(xì)胞的活力。不同濃度的FBS對(duì)BMSCs活力的影響在第1天有差異，但在以后的5 d 3組活力相當(dāng)，沒有差異，說明含體積分?jǐn)?shù)為0.10 FBS的完全培養(yǎng)基已滿足BMSCs的活力，與細(xì)胞周期結(jié)果吻合。

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