應用基因芯片技術篩選轉染CDX2基因后胃癌細胞差異表達基因

陳曉雙，秦 蓉，儲 婧，陳宗科

胃癌是源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發病率居我國惡性腫瘤首位。CDX2尾型同源盒轉錄因子2，位于人類13號染色體，屬于ParaHox cluster成員。目前國內外普遍認為CDX2在腸黏膜上皮細胞的發育及其形態和結構特征的維持過程扮演重要的作用。前期研究［1］顯示CDX2在正常胃黏膜組織、慢性淺表性胃炎中不表達，在腸化組織中的表達明顯高于異型增生和胃癌，在胃癌細胞中CDX2過表達明顯抑制胃癌細胞增殖、降低其遷移能力。該文將CDX2基因和空載體分別轉染至胃癌細胞系BGC-823中，構建實驗組BGC-823/CDX2和陰性對照組BGC-823/EV，利用基因芯片技術篩選CDX2轉染人胃癌細胞BGC-823后差異表達基因;應用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，Real-time PCR)技術對基因芯片結果進行驗證分析，從而確認基因芯片結果準確性。通過尋找受CDX2調控的下游基因，進一步探討CDX2基因在胃癌細胞作用的可能分子機制，為下一步的功能研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達質粒pEGFP-C1-CDX2、空載體pEGFP-C1和人胃癌細胞系BGC-823細胞由本實驗室長期保存。DMEM培養液購于美國Hyclone公司;胎牛血清購于杭州四季青公司;胰酶購于碧云天生物公司;總RNA提取試劑TRIzol購于美國 Invitrogen公司;基因芯片為Affymetrix Human Genome U133 2.0 Array，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit由加拿大 Fermentas公司提供;Attractene Transfection Reagent、QuantiFast SYBR Green PCR Kit、QuantiFastPrimerAssay(DKK3、FOXP1、TWIST1、GATA6、RUNX3、BMP2 和 β-actin)均由德國QIAGEN公司提供。

1.2 方法

1.2.1 BGC-823細胞轉染與篩選 在35 mm培養皿中常規培養BGC-823細胞，取處于對數生長期細胞用胰酶消化，重懸，以2×105/孔的密度接種于6孔板中，以轉染試劑Attractene Transfection Reagent分別介導1.2 μg重組質粒pEGFP-C1-CDX2和陰性對照空載體pEGFP-C1轉染BGC-823細胞。細胞轉染9 h后換液，轉染24 h后，按照1∶4傳代，接種于24孔板中，待細胞貼壁后用G418進行抗性克隆篩選，G418 起初計量為 400 μg/ml，培養 8 h 后，遞減為200 μg/ml，維持此濃度，直至獲得穩定的細胞株，并分別命名為BGC-823/CDX2和BGC-823/EV。

1.2.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測 CDX2 基因mRNA表達 在35 mm培養皿中常規培養BGC-823/CDX2、BGC-823/EV和BGC-823 3組細胞，按照TRIzol說明書提取總 RNA。應用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA逆轉錄為cDNA。CDX2和內參照GADPH由英駿生物技術有限公司合成。CDX2上、下游引物分別為5'-ATCATCGAATTCTGCCACCATGTACGTGAGCTACCTCCTGGA CAAG-3'和5'-ATCATCGGATCCTCACTGGGTGACGGTGGGGTTTAGCA-3'，產物大小 961 bp;內參照GADPH上、下游引物分別為5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'和 5'-CTGGAAGATGGTGATGGG-3'，產物大小210 bp。取3 μl cDNA按常規操作進行PCR擴增，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 總RNA提取及純化 在35 mm培養皿中常規培養BGC-823/CDX2和BGC-823/EV兩組細胞，48 h后收獲細胞，按照 TRIzol說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計Nanodrop-1000測定樣本吸光度，經RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德國)純化樣本并采用凝膠電泳系統Agilent-2100進行檢測。Agilent結果顯示實驗組與對照組28S和18S RNA比值符合芯片檢測要求。

1.2.4 制備cDNA和 cRNA 對兩組樣本總 RNA分別進行以下操作:應用Affymetrix One-cycle cDNA Synthesis Kit將總RNA依次合成1 st cDNA及2 nd cDNA，合成雙鏈cDNA經Affymetrix Genechip Sample Cleanup Module純化。純化后的cDNA經Affymetrix GeneChip IVT Labeling Kit轉錄合成生物素標記cRNA，并應用 Genechip Sample Cleanup Module進行純化。取15 μg純化后的 cRNA，加8 μl 5×Fragmentation Buffer 和 40 μl RNase-Free Water，混勻，94℃溫浴35 min，反應結束后置于冰上使cRNA片斷化，產生的cRNA片段大小為35～200 bp，可用于芯片雜交。

1.2.5 芯片雜交、洗脫和染色 實驗選用的芯片為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，該芯片包含人類全基因組47 000個轉錄本，38 500個明晰的人類基因。取適量片斷化cRNA與芯片進行雜交，45 ℃，60 r/min，16 h。雜交完畢后，從芯片中吸出雜交液，應用Fluidics Station 450進行芯片洗脫和染色。

1.2.6 芯片掃描及數據采集 使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000對芯片進行掃描，并采用Affymetrix GeneChip Operating Software(GCOS)Version 1.4軟件對掃描圖像進行數據分析，根據Ratio值篩選出差異表達基因，并對差異表達基因進行Gene Ontology富集分析(參考網站http://www.geneontology.org)。

1.2.7 Real-time PCR驗證芯片結果 按照TRIzol說明書分別提取BGC-823/CDX2和BGC-823/EV兩組細胞總RNA。應用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總 RNA逆轉錄為 cDNA。使用QuantiFast SYBR Green PCR Kit進行Real-time PCR。DKK3、FOXP1、TWIST1、GATA6、RUNX3、BMP2以及內參照β-actin引物均由QIAGEN公司合成。GATA6引物:QT01001133，產物大小 76 bp;RUNX3引物:QT00040306，產物大小69 bp;BMP2引物:QT00012544，產物大小148 bp;DKK3引物:QT00036057，產物大小 173bp;FOXP1引物:QT00064890，產物大小 96bp;TWIST1引物:QT00011956，產物大小127 bp;內參照β-actin引物:01680476，產物大小104 bp。Real-time PCR反應體系為:95℃，5 min;95℃，10 s;60℃，30 s;重復40個循環;溶解曲線溫度范圍:60～95℃。所有樣本做3個復孔。獲得樣本Ct值，以β-actin作為內參照，根據相對定量法2－ΔΔCt計算差異倍數。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件分析，數據以±s表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1RT-PCR檢測CDX2基因mRNA表達 RTPCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后顯示，BGC-823/CDX2在961 bp位置可觀測到一條清晰的特異性條帶，而空白對照組BGC-823和陰性對照組BGC-823/EV在該位置未出現此條帶，表明穩定轉染細胞株BGC-823/CDX2確有CDX2 mRNA的轉錄。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測人胃癌BGC-823細胞CDX2 mRNA表達M:Marker;1:BGC-823空白對照組;2:BGC-823/EV陰性對照組;3:BGC-823/CDX2轉染組

2.2 基因芯片 經基因芯片篩選CDX2過表達胃癌細胞差異表達基因599個，其中上調基因275個，下調基因324個。對芯片結果進行功能分類，發現差異基因涉及細胞增殖、分化、凋亡和信號轉導、蛋白酶活性、腫瘤侵襲和轉移等方面。部分差異表達基因見表 1、2。

2.3 Real-time PCR驗證分析差異表達基因 根據差異表達基因涉及的不同功能，選擇6個差異表達基因進行Real-time PCR。其結果顯示，與BGC-823/EV比較，DKK3、FOXP1和 TWIST1在 BGC-823/CDX2中表達上調(t=12.100，t=27.845，t=14.072;P ＜0.05)，見圖2;GATA6、RUNX3和 BMP2在BGC-823/CDX2中表達下調(t=－5.548，t=－4.643，t= －3.930;P ＜0.05)，見圖 3。Real-time PCR結果與芯片結果一致，說明芯片結果可靠。

圖2 DKK3、FOXP1和TWIST1在BGC-823/EV和BGC-823/CDX2兩組細胞中的相對表達水平與BGC-823/EV組比較:*P＜0.05

圖3 GATA6、RUNX3和BMP2在BGC-823/EV和BGC-823/CDX2兩組細胞中的相對表達水平與BGC-823/EV組比較:*P＜0.05

表1 部分表達顯著增強的基因

表2 部分表達顯著減弱的基因

3 討論

基因芯片技術的產生和發展與分子生物學、人類基因組計劃密不可分，基因芯片擁有高度并行性、高通量、微型化等顯著特點。目前，基因表達譜芯片可用于檢測腫瘤相關基因表達、進行腫瘤分類和篩選抗腫瘤藥物等，是消化道腫瘤分子水平研究的重要工具。

CDX2基因在人胃癌細胞系BGC-823細胞中低表達，該研究建立在CDX2過表達胃癌細胞系基礎上，利用人類表達譜芯片對該細胞系的表達譜進行初步研究。基因芯片篩選出表達差異基因共599個，其中上調基因275個，下調基因324個。這些差異表達基因在細胞增殖、分化、凋亡，細胞黏附及細胞周期等細胞生理過程中發揮重要調控作用，參與腫瘤細胞的信號轉導、侵襲和轉移等過程。

表達上調基因中，DDR2、GAS1、FAS、DKK3、TWIST1等與細胞增殖、分化、凋亡，腫瘤侵襲轉移有密切聯系。DDR2作為受體型酪氨酸激酶通過纖維性膠原被激活，Kawai et al［2］通過建立 ATDC5 細胞系和miDdr2-transfected ATDC5細胞系小鼠模型探究DDR2在軟骨細胞增殖中的作用，推斷DDR2可能負性調節細胞增殖。GAS1經內在凋亡途徑誘導細胞死亡，可通過調節 BCL-2/Bax比值和激活caspase-3誘導胃癌細胞凋亡［3－4］。死亡受體 FAS是腫瘤壞死因子受體家族重要成員，經FAS/FASL通路轉導死亡信號誘導細胞凋亡［5］。DKK3是Wnt復合物受體拮抗劑，在各種類型腫瘤中表達下調，經Wnt/β-catenin 信號通路抑制腫瘤［6］。TWIST1 是堿性螺旋-環-螺旋蛋白家族中的高度保守的轉錄因子，可誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及促進細胞外基質的降解［7］，在胃癌發生發展和侵襲轉移中扮演重要作用［8］。

表 達 下 調 基 因 中 PAK1、BDNF、CLDN7、RUNX3、BMP2等參與細胞增殖、分化、凋亡，及腫瘤侵襲轉移過程。PAK1是典型的進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是小分子 GTPases Rho、Rac1和Cdc42的重要效應分子。在胃腫瘤轉移的研究中發現PAK1過表達時腫瘤細胞形成張力纖維和黏著斑復合物的能力減弱從而影響細胞骨架重構促進細胞遷移［9］。BDNF與它的主要受體TrkB結合后，使MMP-1表達上調，MMP-1激活肽鏈內切酶降解腫瘤微環境中ECM蛋白從而促進人類軟骨肉瘤細胞遷移，許多腫瘤組織中 BDNF和 TrkB表達上調［10］。CLDN7屬于黏附連接蛋白家族成員，主要表達在彌漫型胃癌，可成為胃腫瘤預后標志物［11］。在正常的胃黏膜上皮細胞中，轉錄因子RUNX3經TGF-β信號通路調節細胞增殖和凋亡，RUNX3對胃黏膜上皮細胞起到保護性作用［12］。骨形成蛋白BMP2屬于TGF-β超家族，在胃癌侵襲和轉移中，BMP2信號通路是通過招募PI3K/AKT和 MAPK通路，從而激活NF-κB 通路，使 MMP-9 激活和腫瘤細胞轉移［13］。

與其他研究方法相比，應用基因芯片技術可以快速高效地獲取CDX2過表達BGC-823細胞的基因表達譜，及大量差異表達基因的信息，從而預測這些基因的功能和基因間的相互關系，以及與CDX2基因的調控關系。然而芯片結果主要反應基因在轉錄水平的變化，具有一定的局限性。

本研究應用人類表達譜芯片成功篩選出CDX2轉染人胃癌細胞系BGC-823細胞后差異表達基因，Real-time PCR驗證芯片結果可靠。隨后的基因功能分析中獲取了許多CDX2可能作用的候選基因，這些基因都可能是CDX2在胃癌組織發生作用的靶點，為深入探討CDX2在胃癌中的作用機制提供了線索。

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